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Aug 07, 2023

Expression divergenter Methyl/Alkyl-Coenzym-M-Reduktasen aus nicht kultivierten Archaeen

Band Kommunikationsbiologie

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1113 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Methanogene und anaerobe methanoxidierende Archaeen (ANME) sind wichtige Akteure im globalen Kohlenstoffkreislauf. Methyl-Coenzym-M-Reduktase (MCR) ist ein Schlüsselenzym im Methanstoffwechsel und katalysiert den letzten Schritt der Methanogenese und den ersten Schritt der anaeroben Methanoxidation. Divergente mcr- und mcr-ähnliche Gene wurden kürzlich in nicht kultivierten Archaeen-Linien identifiziert. Der Aufbau und die Biochemie von MCRs aus nicht kultivierten Archaeen sind jedoch noch weitgehend unbekannt. Hier präsentieren wir einen Ansatz zur Untersuchung von MCRs aus nicht kultivierten Archaeen durch heterologe Expression in einem Methanogen, Methanococcus maripaludis. Promotor, Operonstruktur und Temperatur waren wichtige Determinanten für die MCR-Produktion. Sowohl rekombinantes Methanokokken- als auch ANME-2-MCR assemblierten mit dem Wirts-MCR und bildeten Hybridkomplexe, wohingegen getestetes ANME-1-MCR und Ethyl-Coenzym-M-Reduktase nur homogene Komplexe bildeten. Zusammen mit der Strukturmodellierung deutet dies darauf hin, dass ANME-2- und Methanogen-MCRs strukturell ähnlich sind und ihre Reaktionsrichtungen wahrscheinlich eher durch die Thermodynamik als durch intrinsische Strukturunterschiede reguliert werden.

Methanogene oder methanogene Archaeen gelten als eine der frühesten mikrobiellen Lebensformen auf der Erde1,2 – und spielen zusammen mit anaeroben Methan-oxidierenden Archaeen (ANME) eine zentrale Rolle im globalen Kohlenstoffkreislauf. Heutzutage produzieren Methanogene in anoxischen Umgebungen jährlich etwa eine Milliarde Tonnen Methan unter Verwendung verschiedener Substrate, darunter H2/CO2, Formiat, Acetat und C1-methylierte Verbindungen3 sowie kürzlich entdeckte Verbindungen, darunter Kohlekomponenten4,5 und langkettige Alkane6. Schätzungen zufolge werden in anoxischen Meeressedimenten etwa 90 % des biogenen Methans durch ANME über einen umgekehrten Methanogeneseweg7 zu CO2 oxidiert, wodurch die Freisetzung von Methan in die Atmosphäre gemindert wird.

Alle ANME und viele Methanogene bleiben als Einzelkulturen unkultiviert. Basierend auf Umweltmetagenomen und Anreicherungskulturen sind ANME biochemisch und genetisch eng mit Methanogenen verwandt und verfügen über einen ähnlichen Satz von Enzymen für die anaerobe Methanoxidation (AOM) in der entgegengesetzten Richtung der Methanbildung8,9,10,11. ANME nutzen Methan als Kohlenstoff- und Energiequelle und übertragen Elektronen von Methan auf syntrophische sulfatreduzierende Bakterienpartner9,12,13 oder anorganische Elektronenakzeptoren wie Nitrat14, Fe(III)15,16,17 und Mn(IV)15 . Die bekannten ANME bilden keine einzige taxonomische Gruppe und gehören zu den Ordnungen „Ca. Methanophagales“ (ANME-1) und Methanosarcinales (ANME-2 und ANME-3)10. Die Methanosarcinales-Ordnung enthält auch Methanogene. Die physiologischen und biochemischen Details von ANME bleiben aufgrund des Mangels an Reinkulturen und des langsamen Wachstums von Anreicherungen weitgehend unbekannt8,18.

Die Methyl-Coenzym M (CoM)-Reduktase (MCR) ist ein Schlüsselenzym des anaeroben Methanstoffwechsels19. Es katalysiert die letzte CH4-Bildungsreaktion bei der Methanogenese und die erste CH4-aktivierende Reaktion bei AOM. Die Reversibilität der MCR-Reaktion (Reaktion 1) wurde experimentell mit einem Methanothermobacter marburgensis MCR20 nachgewiesen. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass die verwandte Alkyl-Coenzym-M-Reduktase (ACR) die Oxidation kurzkettiger Alkane (z. B. Ethan, Propan und Butan) durch anaerobe alkanoxidierende Archaeen (ANKA) katalysiert21,22,23,24.

Der MCR-Komplex besteht aus einem Dimer von Heterotrimeren (αβγ)2 mit einem Molekül des Ni-haltigen Tetrapyrrol-Coenzyms F430 in jedem der beiden aktiven Zentren25. Jedes F430 liegt tief im Proteinkomplex verborgen und ist von außen nur über einen 50 Å langen Kanal zugänglich, der aus mehreren Untereinheiten, McrA, A', B und G oder McrA', A, B' und G', besteht26,27. Für die Aktivität ist der Ni(I)-Oxidationszustand von F430 erforderlich. Das Ni(II)/Ni(I)-Paar hat ein extrem negatives Redoxpotential (Eo') unter ‒600 mV28, weshalb MCR sehr sauerstoffempfindlich ist und ein komplexes Enzymsystem für die ATP-abhängige reduktive Aktivierung erfordert29. In der McrA-Untereinheit sind mehrere einzigartige posttranslationale Modifikationen (PTMs) vorhanden, die die MCR-Stabilität und -Aktivität optimieren30,31,32. Obwohl die Kristallstrukturen einer ANME-1-MCR33 und einer Ethyl-Coenzym-M-Reduktase (ECR)34 aufgeklärt wurden, sind der Aufbau und die biochemischen Eigenschaften sowohl der ANME- als auch der ANKA-Enzyme noch immer kaum verstanden. Die heterologe Expression der Gene, die für einen ANME-1-MCR in Methanosarcina acetivorans kodieren, stimulierte die Methanoxidation durch den rekombinanten Organismus und lieferte weitere Beweise für die Rolle dieser Enzyme35. Kürzlich wurde der MCR von Methanothermococcus okinawensis heterolog im Modellmethanogen Methanococcus maripaludis exprimiert36. Hier haben wir die heterologe Expression von MCRs in M. maripaludis weiterentwickelt, was den Weg für die Untersuchung von Enzymkomplexen aus nicht kultivierten Archaeen ebnet.

Jüngste Studien zur Umweltgenomik haben viele archaische Abstammungslinien potenzieller Methanogene und ANME aufgedeckt, die bisher nicht kultiviert wurden10. Hier untersuchten wir die Verteilung von MCR-Homologen über 1070 zusammengesetzte Archaeengenome aus der Genome Taxonomy Database (GTDB) mit einer Vollständigkeit von >80 % und einer Kontamination <10 %. Insgesamt 307 Genome enthielten alle drei Gene (mcrA, mcrB und mcrG), die zur Kodierung der MCR-Untereinheiten erforderlich waren (Supplementary Data 1). Im rangnormalisierten phylogenetischen Baum, der auf allen 1070 Genomen basiert37, umfassten diese mcr-haltigen Archaeen Methanogene, ANME-1, ANME-2, ANKA und andere Archaeen unbekannter Stoffwechseltypen und waren mit Abstammungslinien durchsetzt, die diese Gene nicht gemeinsam haben ( Abb. 1). Die weitverbreitete Verbreitung von mcr-Genen in Archaeen stützt die Hypothese, dass der Methanstoffwechsel ein uraltes Merkmal ist, das wahrscheinlich in der Archaeenwurzel vorhanden ist38,39,40.

Insgesamt wurden 307 mcr-Gene aus 1070 Archaeengenomen identifiziert, darunter Methanogene (n = 252), ANME-1-Klade (n = 5), ANME-2 (n = 20), ANKA (n = 9) und andere Archaeen unbekannter Stoffwechsel (n = 21). Die Zugangsnummern sind in den Zusatzdaten 1 angegeben. Farbschattierung: grün, Methanogene; lila, ANME-1-Archaeen; rot, ANME-2-Archaeen; orange, vorgeschlagene ANKAs; Grau, Archaeen, die mcr mit unbekannten Funktionen enthalten. Die Operonstrukturen (mcrBDCGA, mcrBDGA oder mcrBGA) werden durch mehrere Ringe außerhalb des rangnormalisierten phylogenetischen Baums dargestellt. BDCGA (in Blau), mcrBDCGA-Operon; BDGA (in Cyan), mcrBDGA-Operon; BGA (in Magenta), mcrBGA-Operon; Ungewöhnlich (in Schwarz): mcr-Genen fehlen die drei bekannten gemeinsamen Operonstrukturen. Mehrere Treffer eines einzelnen Genoms weisen auf das Vorhandensein mehrerer Kopien von mcr hin. Taxonomische Klassifizierung: P-Stamm, C-Klasse, O-Ordnung, F-Familie, G-Gattung, S-Art. Abstammungslinien ohne mcr wurden auf Auftragsebene gekürzt.

Zusätzlich zu den Strukturgenen kodierten viele mcr-Operons für zwei akzessorische Proteine, McrC und McrD. Während die Rollen von McrC und D nicht gut charakterisiert sind, wurde gezeigt, dass McrC am MCR-Aktivierungskomplex29 beteiligt ist und McrD möglicherweise die Zugabe von Coenzym F430 zum Komplex41 erleichtert. Es wurden drei Hauptstrukturen des mcr-Operons identifiziert, mcrBDCGA, mcrBDGA und mcrBGA, die ein starkes phylogenetisches Signal besaßen (Abb. 1). Bemerkenswerterweise enthielten Methanogen- und ANME-2-Genome überwiegend die mcrBDCGA- und mcrBDGA-Operons; wohingegen ANME-1-Genome das kürzere mcrBGA-Operon mit mcrC an einem separaten Ort besaßen (Abb. 1). Die ANKA-Genome besaßen hauptsächlich ein oder mehrere mcrBGA- und/oder mcrBAG-Operons. Das Fehlen von mcrD-Homologen in ANME-1- und ANKA-Genomen könnte ein Symbol für andere große Unterschiede zwischen den Enzymen und Methanogenen sein. Sie enthalten beispielsweise modifizierte nickelhaltige F430-Cofaktoren, z. B. thiomethyliertes F430 aus einem ANME-1 MCR33 und dimethyliertes F430 aus Candidatus Ethanoperedens thermophilum MCR34.

Genduplikationen von mcr kommen bei Archaeen häufig vor. Unter den Methanogenen weisen viele Genome der Ordnungen Methanobacterias, Methanococcales und Methanomicrobiales eine Kopie von mcrBDCGA und eine zweite Kopie von entweder mcrBDGA oder mcrBGA auf (Supplementary Data 1). In M. marburgensis werden die beiden MCR-Isoenzyme je nach H2-Konzentration unterschiedlich exprimiert42,43,44, was darauf hindeutet, dass mcr-Duplikationen eine Rolle bei der physiologischen Gewöhnung an unterschiedliche Wachstumsbedingungen spielen könnten. Andererseits weisen die vorgeschlagenen ANKA-Genome häufig mehrere mcrBGA/BAG-Operons auf21,45,46, was darauf hindeutet, dass mcr-Duplikationen seine Funktion vom Methan- auf den Multikohlenstoff-Alkan-Metabolismus erweitert haben könnten.

Die heterologe Expression von MCRs in M. maripaludis wurde systematisch optimiert. Zunächst wurde ein konstitutiver Histon-Promotor (PhmvA)36 mit einem kürzlich entwickelten phosphatabhängigen Promotor (Ppst)47 verglichen, der die Expression bei Phosphatlimitierung initiiert und die Expression teilweise vom Wachstum trennt. Am N-Terminus von McrG aus dem mcrBDCGA-Operon von Methanococcus aeolicus wurde ein Flag-Strep2-Tag hinzugefügt (Abb. 2a). Basierend auf Western Blot aus einer früheren Studie ergaben die PhmvA- und Ppst-Promotoren einen MCR (MCRaeo) von M. aeolicus von 2,4 % bzw. 5,8 % des Gesamtproteins47. Somit war der Ppst-Promotor überlegen und wurde in nachfolgenden Experimenten verwendet. Zweitens wurde die Auswirkung der Tag-Positionen untersucht. Der Flag-Strep2-Tag wurde an den N-Terminus von McrG (NG), den N-Terminus von McrB (NB) oder den C-Terminus von McrA (CA) von MCRaeo hinzugefügt. Die Identität der gereinigten Proteine ​​wurde durch Massenspektrometrie nach SDS-PAGE bestätigt (Abb. 2b). Zusätzlich zu den McrB-, G- und A-Untereinheiten wurden geringe Mengen McrD identifiziert. In allen drei Fällen betrugen die MCRaeo-Ausbeuten etwa 6 % der gesamten zellulären Proteine, was darauf hindeutet, dass die Tag-Positionen keinen Einfluss auf das Proteinproduktionsniveau hatten. Die ultraviolett-sichtbaren (UV-Vis)-Spektren des gereinigten MCRaeo zeigten einen maximalen Absorptionspeak bei 425 nm, der typisch für das MCR-Holoenzym war und etwas niedriger als das Absorptionsmaximum von Methanol-extrahiertem F430 bei 430 nm (Abb. 2c). . Basierend auf dem molaren Extinktionskoeffizienten ε430nm = 22.500 M−1 cm−1 und einer HPLC-basierten Analyse (ergänzende Abbildung S1) wurde das gereinigte MCRaeo mit NB- oder NG-Tags vollständig mit F430 zusammengesetzt, während das CA-Tag den F430-Gehalt reduzierte um 30 % (Abb. 2c). Daher wirkten sich die Tag-Positionen auf die F430-Montage aus, und die NB- und NG-Tags waren für die Produktion des Holo-MCR geeignet. Schließlich wurde das Vorhandensein von PTMs – einschließlich Thioglycin, 1-N-Methylhistidin, 5-(S)-Methylarginin und 2-(S)-Methylglutamin – des rekombinanten McrAaeo durch Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS) identifiziert /MS) (Ergänzungstabelle 1). Dies deutete darauf hin, dass unser heterologes Expressionssystem zu denselben PTMs führte, die für M. maripaludis und eng verwandte M. okinawenesis-MCRs gefunden wurden.

a Die mcr-Operonstruktur von M. aeolicus (mcraeo) und M. maripaludis (mcrmar). b SDS-PAGE-Analyse des rekombinanten MCRaeo und MCRmar, gereinigt durch Strep-Tag-Affinität und Ionenaustauschchromatographie aus M. maripaludis. Die auf Standards basierenden Molekulargewichte sind links angegeben. Der Flag-Strep2-Tag wurde an die Positionen C-Terminus von McrA (CA), N-Terminus von McrB (NB) oder N-Terminus von McrG (NG) angefügt. Alle Untereinheiten wurden durch MALDI-TOF-MS identifiziert und rechts markiert. McrG1 und McrG2 repräsentieren markiertes bzw. nicht markiertes McrG. c UV-sichtbare Spektren von gereinigtem rekombinantem MCRaeo und MCRmar (alle bei einer Konzentration von 7,5 mg mL-1) im Vergleich zu Coenzym F430, das aus dem MCR von M. marburgensis extrahiert wurde. d Die relative Häufigkeit von M. aeolicus (in grau) vs. Wirts-M. maripaludis (in orange) MCR in jeder Untereinheit des gereinigten rekombinanten MCRaeo-Komplexes, bestimmt durch LC-MS/MS. Die prozentualen Anteile des M. maripaludis-Proteins am Gesamtprotein jeder Untereinheit sind gekennzeichnet.

Obwohl sich das rekombinante MCRaeo zu einem Holokomplex zusammenfügte, zeigte SDS-PAGE, dass der NG-markierte Komplex eine zusätzliche McrG2-Untereinheit enthielt (Abb. 2b). Massenspektrometrie ergab, dass McrG1 und G2 mit Flag-Strep2 markierte McrGaeo bzw. der nicht markierte Wirt M. maripaludis McrGmar waren. Dieser Chimärismus wurde auch für MCRaeo beobachtet, das mit anderen Tag-Positionen und dem rekombinanten M. maripaludis MCR exprimiert wurde (Abb. 2b, d). Das M. maripaludis-McrG machte unabhängig von den Tag-Positionen 30 ± 6 % des gesamten McrG aus. Im Gegensatz zu McrG fanden LC-MS/MS-Analysen des rekombinanten MCRaeo-Komplexes nur geringe Mengen an M. maripaludis McrA und McrB (Abb. 2d). Die chimären Komplexe wurden durch native PAGE und Massenspektrometrie intakter Proteine ​​weiter charakterisiert (Abb. 3). Zwei Komplexe (Komplex I und II) wurden für das gereinigte rekombinante MCRaeo und MCRmar mit nativer PAGE beobachtet (Abb. 3a). SDS-PAGE der beiden Komplexe ergab, dass sie sich in der Anwesenheit des zusätzlichen, nicht markierten M. maripaludis McrG unterschieden (Abb. 3b). Die Massenspektrometrie intakter Proteine ​​ergab, dass die Komplexe I und II Molekularmassen von 288,4 bzw. 283,8 kDa aufwiesen (Abb. 3c und Ergänzungstabelle 2). Dementsprechend stimmte Komplex I mit einem α2β2h2f2-Komplex überein, wobei α, β, h und f M. aeolicus McrA, McrB, markiert mit McrG bzw. F430, entsprechen. Komplex II stimmte mit einem α2β2hγf2 überein, wobei γ dem nicht markierten M. maripaludis McrG entsprach (Abb. 3d). Diese Ergebnisse zeigten, dass McrG problemlos McrA- und B-Untereinheiten unterschiedlichen Ursprungs bindet.

eine Native-PAGE-Analyse des gereinigten rekombinanten MCRaeo und MCRmar. Bei beiden Konstrukten wurde am N-Terminus von McrG ein Flag-Strep2-Tag hinzugefügt. b Die beiden Komplexe von MCRaeo wurden aus nativen PAGE-Gelschnitten eluiert, mittels SDS-PAGE analysiert und mit Silber gefärbt. c Die nativen Molekülmassen der MCRaeo-Komplexe I und II wurden durch Massenspektrometrie intakter Proteine ​​zu 288,4 bzw. 283,8 kDa bestimmt. Die Ladungen der Peaks sind beschriftet. d Modelle der Komplexe I und II. A, B und Gaeo repräsentieren die Untereinheiten McrA, McrB und McrG von M. aeolicus. Gmar bezeichnet den nicht markierten Wirt M. maripaludis McrG. Die schwarze Linie symbolisiert das Tag. F steht für Coenzym F430.

Die akzessorischen Proteine ​​McrC und McrD sind in mcr-Operons von Methanogenen hoch konserviert, fehlen jedoch häufig in denen von ANME und ANKA. Um ihre Rolle bei der MCR-Assemblierung zu untersuchen, wurden verkürzte M. aeolicus mcr-Operons – einschließlich mcrBDGA, mcrBCGA und mcrBGA – konstruiert. In allen Fällen wurde das Flag-Strep2-Tag an der NG-Position hinzugefügt. Die Expression von MCRaeo aus allen drei verkürzten Operons ergab Komplexe, die denen des vollständigen mcrBDCGA-Operons ähnelten (Abb. 4a, b). UV-Vis-Spektren (Abb. 4c) und HPLC-Analyse bestätigten die vollständige Ergänzung von F430 im gereinigten MCRaeo. Darüber hinaus waren auch die wichtigsten PTMs vorhanden (Ergänzungstabelle 1). Allerdings waren die Expressionsniveaus verkürzter mcr-Operons etwa dreimal niedriger als die des vollständigen Operons (Abb. 4d), obwohl die Ursache für die verringerten Proteinniveaus derzeit unklar ist. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Vorhandensein von mcrCD im mcr-Operon für die MCR-Assemblierung und PTMs nicht erforderlich war.

eine SDS-PAGE-Analyse des rekombinanten MCRaeo, gereinigt durch Strep-Tag-Affinität und Ionenaustauschchromatographie. Bei allen Konstrukten wurde am N-Terminus von McrG ein Flag-Strep2-Tag hinzugefügt. Die Operonstrukturen sind über jeder Spur beschriftet. Die auf Standards basierenden Molekulargewichte sind links angegeben. Alle Untereinheiten wurden durch MALDI-TOF-MS identifiziert und rechts markiert. b Die relative Häufigkeit von M. aeolicus (in grau) vs. Wirts-M. maripaludis (in orange) MCR in jeder Untereinheit der co-gereinigten Komplexe, bestimmt durch LC-MS/MS. Die prozentualen Anteile des M. maripaludis-Proteins am Gesamtprotein jeder Untereinheit sind gekennzeichnet. c UV-Vis-Spektren von gereinigtem MCRaeo (alle bei einer Konzentration von 7,5 mg mL-1) im Vergleich zu aus MCR extrahiertem Coenzym F430. d Expressionsniveaus von rekombinantem MCRaeo, bestimmt durch Western Blot. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von vier unabhängigen Kulturen dar.

Es wurde vorgeschlagen, dass McrC in trans wirkt, d. h. eine Co-Transkription von mcrC mit dem mcr-Operon war für seine Funktion nicht erforderlich, basierend auf der Beobachtung, dass das McrC von M. marburgensis gemeinsam mit dem MCR-Aktivierungskomplex gereinigt wurde, der außerhalb des mcr-Operons kodiert wurde mcr operon29. Um diese Hypothese zu testen, wurden zwei Pulldown-Experimente durchgeführt. Zunächst wurden die mcrBDCGA-Gene von M. aeolicus mit einem Flag-Strep2-Tag am N-Terminus von McrC (McrCaeo) exprimiert. Die McrA-, B- und G-Untereinheiten von M. aeolicus (transkribiert von einem Plasmid) und des Wirts M. maripaludis (transkribiert vom Genom) wurden gemeinsam mit dem markierten McrCaeo gereinigt (Abb. 5a, c), was darauf hindeutet, dass McrC interagiert direkt mit beiden MCRs unabhängig von der Co-Transkription. Zweitens wurde der mit Flag-Strep2 markierte M. maripaludis McrC (McrCmar) allein von einem Plasmid exprimiert. Das markierte McrCmar wurde auch zusammen mit den drei aus dem Genom exprimierten MCR-Untereinheiten gereinigt (Abb. 5a). Darüber hinaus wurden andere Proteine, die nicht aus mcr-Operons stammen, sowohl mit dem markierten McrCaeo als auch mit dem markierten McrCmar gemeinsam gereinigt. Zu diesen Proteinen gehörten zwei zuvor identifizierte Komponenten des MCR-Aktivierungskomplexes (Komponente A2 und Methanogenese-Markerprotein 7)29 und zwei weitere Methanogenese-Markerproteine ​​3 und 17 (Abb. 5a).

a Das McrCaeo-Konstrukt hatte das vollständige mcrBDCGA-Operon von M. aeolicus mit dem Flag-Strep2-Tag am N-Terminus von McrC. Das McrCmar-Konstrukt enthielt nur das M. maripaludis mcrC mit einem N-terminalen Flag-Strep2-Tag. Mit McrCaeo und McrCmar gemeinsam gereinigte Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch MALDI-TOF-MS identifiziert. Proteine, die nur mit McrCaeo gereinigt wurden, sind rot markiert. Zu den co-gereinigten Proteinen (in Fettdruck) gehören neben MCR-Untereinheiten auch M. maripaludis A2-Protein (Locus-Tag Mmp_0620), MMP3 (Methanogenese-Markerprotein 3, Locus-Tag Mmp_0154), MMP7 (Methanogenese-Markerprotein 7, Locus-Tag Mmp_0421) und MMP17 (Methanogenese-Markerprotein 17, Locus-Tag Mmp_0656) und Hitzeschockprotein Hsp20 (Locus-Tag Mmp_0684). b Das McrDaeo-Konstrukt hatte das vollständige mcrBDCGA-Operon von M. aeolicus mit dem Flag-Strep2-Tag am N-Terminus von McrD. Mit McrDaeo gemeinsam gereinigte Proteine ​​wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und durch MALDI-TOF-MS identifiziert. c Die relative Häufigkeit von M. aeolicus (in grau) vs. Wirts-M. maripaludis (in orange) MCR in jeder Untereinheit der gereinigten Komplexe, bestimmt durch LC-MS/MS. Die prozentualen Anteile des M. maripaludis-Proteins am Gesamtprotein jeder Untereinheit sind gekennzeichnet.

Zwei Experimente bestätigten, dass McrD in trans funktioniert. Erstens war der Wirt M. maripaludis McrD in den gereinigten rekombinanten M. aeolicus-MCRs vorhanden, die sowohl vom vollständigen als auch vom verkürzten mcr-Operon ohne mcrD exprimiert wurden (Abb. 4a). Zweitens wurde das M. aeolicus-Operon, das für ein Flag-Strep2-Tag am N-Terminus von McrD (McrDaeo) kodiert, von einem Plasmid in M. maripaludis für ein Pulldown-Experiment exprimiert. Alle drei MCR-Untereinheiten von M. aeolicus und M. maripaludis wurden gemeinsam mit dem markierten McrDaeo gereinigt (Abb. 5b, c), was darauf hindeutet, dass McrDaeo mit dem aus dem Genom exprimierten Wirts-MCR interagierte.

Das robuste Expressionssystem wurde zur Herstellung von MCRs aus nicht kultivierten Archaeen eingesetzt. Zwei ANME-1-MCRs, vier ANME-2-MCRs und ein ECR wurden für die heterologe Expression ausgewählt (Ergänzungstabelle 3). In allen Fällen wurde das Flag-Strep2-Tag unter der Kontrolle des Ppst-Promotors an den N-Terminus von McrG angefügt. Die Temperatur wurde als wichtiger Faktor für die ANME MCR- und ECR-Produktion identifiziert. Bei 37 ° C, der optimalen Wachstumstemperatur des Wirts M. maripaludis, wurden durch Western Blot nur geringe Mengen an rekombinanten MCRs nachgewiesen (ergänzende Abbildung S2), obwohl die durch qRT-PCR quantifizierten mRNA-Kopienzahlen auf eine höhere Menge an mRNA schließen ließen für den rekombinanten ANME-1_G37-MCR als für den nativen Wirts-MCR (ergänzende Abbildung S3). Da viele ANME-Metagenome aus Tiefseesedimenten gewonnen wurden, in denen die Temperaturen nahe 2 °C lagen, wurde die Expression bei niedrigeren Temperaturen untersucht. Nach einem Wachstum nahe dem Temperaturminimum von M. maripaludis (25 °C) war die Expression von ANME-MCRs und ECR deutlich verbessert. Beispielsweise machten ANME-1_BS und ANME-2b_HR1 1–1,5 % der gesamten zellulären Proteine ​​aus (ergänzende Abbildung S2). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die ANME-MCRs und ECR bei höheren Temperaturen instabil oder anfällig für einen Abbau sind, wenn sie in M. maripaludis exprimiert werden.

Die Proteinzusammensetzungen des gereinigten ANME-1_BS MCR (MCRANME-1_BS), ANME-2b_HR1 MCR (MCRANME-2_HR1) und Ca. Ethanoperedens thermophilum E50 ECR (ECRE50) wurden weiter untersucht (Abb. 6a). Die massenspektrometrische Analyse bestätigte, dass das gereinigte MCRANME-1_BS und ECRE50 alle drei Untereinheiten McrA, B und G (Abb. 6b, c) ohne den MCR des Wirts M. maripaludis umfasste. Im Gegensatz dazu wurde das markierte McrG von ANME-2b_HR1 gemeinsam mit den drei M. maripaludis-MCR-Untereinheiten gereinigt (Abb. 6d), was darauf hindeutet, dass sich McrGANME-2_HR1 und MCRmar zu einem Hybridkomplex zusammenfügten. Proteinsequenz-Alignments zeigten, dass das McrG von ANME-1 eine längere C-terminale Verlängerung aufweist als die von Methanogenen, ANME-2 und Ca. E. thermophilum (Ergänzende Abbildung S4); Diese Erweiterung kann Wechselwirkungen mit dem Methanokokken-MCR des Wirts hemmen.

a Allgemeine Informationen und Operonstrukturen von MCRANME-1_BS, MCRANME-2b_HR1 und ECRE50. b–d SDS-PAGE-Analyse des gereinigten MCRANME-1_BS, ECRE50 und MCRANME-2_HR1, hergestellt aus M. maripaludis, gewachsen bei 25 °C. Die auf Standards basierenden Molekulargewichte sind links angegeben. Proteinidentitäten (rechts markiert) wurden durch MALDI-TOF-MS bestätigt. Das markierte McrGANME-2_HR1 wurde gemeinsam mit dem Wirt MCRmar gereinigt. e Gesamtpunktzahl (Rosetta-Energieeinheit; REU) vs. I_rmsd-Diagramm für lokale Docking-Simulationen von McrGANME-1_BS (blau) und McrGANME-2_HR1 (rot) an den M. maripaludis McrA, B, G-Komplex. Das Diagramm zeigt 60.000 Bewertungsmodelle. Das beste Modell, das durch das Andocken von McrGANME-1_BS erhalten wurde, hatte einen I_rmsd von 5,869 Å und einen Gesamtwert von -4965,008. Das beste Modell, das durch das Andocken von McrGANME-2_HR1 erhalten wurde, hatte einen I_rmsd von 1,848 Å und einen Gesamtwert von -5133,935. Die zehn niedrigsten Energiewerte mit I_rmsd < 2,5 Å sind im schwarzen Kasten gekennzeichnet. f, g Strukturmodelle mit dem kleinsten I_rmsd in der Simulation des Andockens von McrGANME-1_BS (Magenta, f) und McrGANME-2_HR1 (Magenta, g) an M. maripaludis McrA (grün), B (cyan), G (gelb). ) komplex. Die Proteinuntereinheiten werden im Cartoon dargestellt und F430 und CoB-SH werden in Stabmodellen dargestellt. Aus Gründen der Übersichtlichkeit sind nur ein aktives Zentrum, bestehend aus den Untereinheiten McrA (grün), A' (gelb), B (cyan) und ANME McrG (magenta) von M. maripaludis, sowie ein F430 dargestellt. Die Aminosäuren innerhalb von 8 Å um F430 herum sind als Oberflächendarstellung dargestellt. h Die zehn Aminosäuren von McrGANME-2_HR1 innerhalb von 8 Å um F430 herum sind links markiert und in Stabmodellen dargestellt.

Die strukturellen Grundlagen der MCR-Hybridkomplexbildung wurden durch Computermodellierung weiter analysiert. Ein Homologiemodell des M. maripaludis-MCR-Komplexes wurde mit RosettaCM48 erstellt (ergänzende Abbildung S5) und von RosettaDock für das Protein-Docking mit McrG aus ANME-1_BS und ANME-2b_HR1 verwendet (Abb. 6e – g). Das In-silico-Andocken von McrGANME-2_HR1 mit M. maripaludis MCR war mit der niedrigsten quadratischen mittleren Abweichung der Schnittstelle (I_rmsd) = 1,848 Å erfolgreich (Abb. 6e). In diesem Modell wurden 10 Aminosäuren von McrGANME-2_HR1 innerhalb von 8 Å um F430 herum identifiziert (Abb. 6h), was mit den angegebenen F430-Bindungsstellen übereinstimmt (ergänzende Abb. S4)26,51. Im Gegensatz dazu hatte das Andocken von McrGANME-1_BS an M. maripaludis MCR eine schlechte Qualität (I_rmsd = 5,869 Å) (Abb. 6e), und zwischen McrGANME-1_BS und F430 wurde keine Interaktionsoberfläche innerhalb von 8 Å beobachtet (Abb. 6f). . Diese Simulationen stimmten mit den experimentellen Daten überein, dass ANME-2- und Methanokokken-MCR-Untereinheiten einen Hybridkomplex bilden können, während ANME-1-MCR nur als homogener Komplex gereinigt wurde.

In dieser Studie wurde ein robustes MCR-Expressionssystem in M. maripaludis mit einem Flag-Strep2-Tag am N-Terminus von McrG unter der Kontrolle des Ppst-Promotors entwickelt. Dieses System erhöhte die MCR-Expression im Vergleich zu anderen Promotoren, wie dem konstitutiven PhmvA, um das Zwei- bis Dreifache und ermöglichte eine schnelle Reinigung markierter Holo-MCRs. Mit diesem System wurden rekombinante MCRs vollständig mit Coenzym F430 zusammengesetzt und enthielten die im M. maripaludis-MCR vorhandenen PTMs. Obwohl die Ausbeute an ANME-MCR derzeit geringer ist als bei methanogener MCR, stellte diese Studie einen wichtigen Schritt für biochemische und mechanistische Studien von MCR-Homologen aus nicht kultivierten Archaeen dar.

Unser heterologer Ausdruck lieferte mechanistische Einblicke in die MCR-Assemblierung. Zuvor haben wir ein geordnetes Montagemodell für die Herstellung von MCR in M. maripaludis vorgeschlagen. In diesem Modell erfolgte die Transkription des mcr-Operons gleichzeitig mit der Translation und dem Zusammenbau der Untereinheiten in das reife Holoenzym mit korrekten PTMs. Obwohl die hier berichteten Experimente nicht dazu gedacht waren, kritische Tests dieses Modells durchzuführen, deuten sie doch darauf hin, dass das ursprüngliche Modell zu einfach war. Beispielsweise waren die Gene für die akzessorischen Proteine ​​McrC und McrD im Operon für die vollständige MCR-Assemblierung mit F430-Insertion und korrekten PTMs nicht erforderlich, wie das vorherige Modell nahelegte. Allerdings wurde das Niveau der Komplexproduktion bei M. maripaludis um etwa 60 % reduziert, wenn mcrC und/oder mcrD im Operon fehlten. Darüber hinaus zeigten Pulldown-Experimente, dass diese akzessorischen Proteine ​​in trans funktionieren können. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Operonstruktur möglicherweise eine wichtige Rolle spielt, für die MCR-Assemblierung jedoch nicht wesentlich ist, was mit dem Fehlen von mcrC/D in den meisten ANME- und ANKA-mcr-Operons übereinstimmt. Zweitens war McrG hochgradig chimär und zu Komplexen unterschiedlicher Herkunft zusammengesetzt, obwohl der Chimärismus für die McrA- und McrB-Untereinheiten gering war, wie das geordnete Assemblierungsmodell vorhersagte. Es ist möglich, dass die Zugabe von McrG während des Zusammenbaus weniger selektiv ist als die von McrA und McrB. Beispielsweise könnte McrG die letzte Untereinheit sein, die sich dem McrAB-Komplex anschließt und Coenzym F430 einbringt. Alternativ kann McrG mobil sein. Nach der anfänglichen Assemblierung in MCR, wie durch das geordnete Assemblierungsmodell vorhergesagt, wird es zwischen reifen nativen und rekombinanten MCRs ausgetauscht. Um zwischen diesen und anderen Hypothesen zu unterscheiden, sind weitere Experimente erforderlich.

Unsere Proteincharakterisierung und Strukturmodellierung zeigte, dass ANME-2- und Methanokokken-MCR-Untereinheiten einen Hybridkomplex bilden können, was darauf hindeutet, dass sie einander strukturell und biochemisch ähnlicher sind als ursprünglich angenommen. ANME-2-Archaeen gehören zur Ordnung der Methanosarcinales, die sich phylogenetisch von der Ordnung der Methanococcales unterscheidet. Obwohl gezeigt wurde, dass M. marburgensis MCR reversible CH4-Produktions-/CH4-Oxidationsreaktionen in vitro katalysiert20 und ANME-Archaeen in einigen methanogenen Sedimenten dominant waren52,53,54,55, konnte eine solche Reversibilität unter physiologischen Bedingungen noch nicht nachgewiesen werden. Unsere Ergebnisse lieferten weitere Beweise dafür, dass Methanogenese und Methanotrophie eher durch thermodynamische Treiber als durch intrinsische Unterschiede der MCRs bei Methanogenen und ANME reguliert werden.

Die meisten Archaeengenome wurden aus der Genome Taxonomy Database (GTDB, https://gtdb.ecogenomic.org/) abgerufen. Das ANME-1_BS-Genom (Zugangsnummer FP565147) stammte aus der NCBI-Nukleotiddatenbank. Die Ca. Das E50-Genom von Ethanoperedens thermophilum wurde von der GenBank-Assembly heruntergeladen (Zugangsnummer GCA_905171685.1)24. Die taxonomischen Zuordnungen wurden mithilfe einer Analyse der relativen evolutionären Divergenz mit GTDB Release 95 in Einklang gebracht37. Die Genome wurden mit CheckM56 auf ihre Vollständigkeit und Kontamination analysiert. Für diese Studie wurde ein Satz von 1070 Genomen mit einer Vollständigkeit von >80 % und einer Kontamination <10 % ausgewählt. Die mcr-Gene wurden unter Verwendung von tblastn mit Methanococcus maripaludis-Stamm S2 und Methanosarcina acetivorans-Stamm C2A-MCRs als Abfragesequenzen durchsucht. Die identifizierten Subjektsequenzen wurden ausgeschlossen, wenn ihre Expect-Werte (E) größer als 1e-5 waren. Operonstrukturen wurden erkannt, wenn sich die identifizierten mcr-Gene auf demselben Contig und Strang befanden und der Abstand zwischen zwei benachbarten Genen kleiner als 250 bp war.

Der Genom-Taxonomiebaum wurde mithilfe der Graphical Phylogenetic Analysis57 erstellt, einem Python-basierten Befehlszeilen-Baumzeichnungstool, das vom Huttentower-Labor entwickelt wurde. Die Taxonomie und Benennung des Genoms stimmt mit der GTDB-Veröffentlichung 9537 überein. Die Muster der entdeckten Operons wurden durch mehrere Ringe außerhalb des kreisförmigen phylogenetischen Baums dargestellt. Mehrere Treffer eines einzelnen Genoms weisen darauf hin, dass in diesem Genom mehrere Kopien von mcr vorhanden sind.

Die rekombinanten M. maripaludis-Stämme wurden anaerob bei 25 oder 37 °C gezüchtet. Die Zellen wurden in 28-ml-Röhrchen mit Aluminiumdeckel und Gummistopfen mit 5 ml minimalem Formiatmedium (McF) oder reichem Formiatmedium (McFc, McF plus 2 g L−1 Casaminosäuren) kultiviert58. Der Kopfraum betrug 104 kPa N2/CO2 (4:1, Vol./Vol.). Die 1,5-l-Kulturen wurden in einem McF-Medium auf Formiatbasis mit limitierendem (80 μM) dibasischem Kaliumphosphat (K2HPO4) gezüchtet. Das Inokulum wurde in 5 ml McFc vorgezüchtet und dann in McF mit 80 μM K2HPO4 überführt, bevor 4 % Volumen in die Versuchskulturen inokuliert wurden. Bei Bedarf wurde Puromycin (1,25 oder 2,5 μg mL-1) hinzugefügt. Vor der Beimpfung wurde 3 mM Natriumsulfid als Schwefelquelle zugesetzt.

Die mcr-Gene wurden in den pMEV4-Shuttle-Vektor mit einem Flag-Strep2-Tag unter der Kontrolle des 93-bp-Ppst-Promotors kloniert47. Zur Proteinexpression wurden die Plasmide mithilfe der durch Polyethylenglykol vermittelten Transformationsmethode60 in M. maripaludis S000159 transformiert. Die Plasmide wurden in den rekombinanten M. maripaludis-Stämmen durch Zugabe von 1,25 oder 2,5 μg mL-1 Puromycin zum Medium gehalten. Die Kolonien der ausgewählten Transformanten wurden durch PCR und Sequenzierung verifiziert.

M. maripaludis-Kulturen, die rekombinantes MCRaeo oder MCRmar exprimierten, wurden bei 37 °C in 1,5 l McF mit 80 μM K2HPO4 gezüchtet, bis sie eine Absorption bei 600 nm von 0,5–0,7 erreichten. Die Proteinreinigung wurde unter aeroben Bedingungen durchgeführt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation bei 17.700 × g für 20 Minuten bei 4 °C geerntet und dann in 5 ml Bindungspuffer resuspendiert, der 100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl und Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten (Roche, New York) enthielt , MO, USA). Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung (Fisher Scientific Sonic Dismembrator Model 100) unter Verwendung eines Zyklus von 5 s EIN/AUS mit einer Ausgangsleistung von 4 und einem Arbeitszyklus von 40 % für 20 Minuten auf Eis lysiert. Das Zelllysat wurde 20 Minuten lang bei 4 ° C und 17.700 × g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die überstehende Fraktion wurde auf eine Säule geladen, die 1 ml Strep-Tactin Superflow Plus-Harz (IBA Lifesciences, Göttingen, Deutschland) enthielt, das mit dem Bindungspuffer äquilibriert war. Die Säule wurde mit dem Bindungspuffer gewaschen und die Proteine ​​wurden mit dem Elutionspuffer eluiert, der 100 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl und 2,5 mM Desthiobiotin enthielt. Die eluierten Fraktionen wurden entsalzt und mit einem Amicon Ultra-Zentrifugalfilter (Millipore, Molekulargewichtsgrenze 10 kDa) durch Zentrifugation bei 5000 × g für 20 Minuten bei 4 °C konzentriert und mit 4 ml Puffer A mit 50 mM Tris-HCl ergänzt ( pH-Wert 7,6). Die Proteinlösung wurde dann unter Verwendung eines NGC-Flüssigkeitschromatographiesystems (Bio-Rad) auf eine mit Puffer A äquilibrierte Q-Sepharose XK16-Anionenaustauschsäule geladen. Das Protein wurde mit einem linearen Gradienten von 0 % bis 100 % Puffer B (Puffer A plus 1 M NaCl) eluiert. Die farbigen Fraktionen, die Coenzym F430 enthielten, wurden gepoolt und unter Verwendung eines 10-kDa-Cutoff-Zentrifugalfilters auf 1 ml konzentriert. Die Proteinkonzentrationen wurden mit einem Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific) bestimmt.

M. maripaludis-Kulturen, die ANME MCR exprimierten, wurden bei 25 °C in 1,5 l McF mit 80 μM K2HPO4 gezüchtet, bis sie eine Absorption bei 600 nm von 0,5–0,7 erreichten. Die Reinigung von ANME MCR wurde mithilfe der Strep-Tactin-Affinitätschromatographie wie oben beschrieben durchgeführt. Nach der Konzentration mit dem 10-kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter wurden Strep-Tactin XT-Magnetkügelchen (IBA Lifesciences, Göttingen, Deutschland) verwendet, um ANME-MCRs gemäß den Anweisungen des Herstellers weiter zu reinigen.

Zur Quantifizierung von Protein, das F430 enthält, wurden UV-sichtbare Absorptionsspektren mit einem Agilent Cary 60 UV-Vis-Spektrometer (Agilent Technologies Inc., Palo Alto, CA, USA) mit Proben in einer Quarzküvette mit 10 mm Weglänge aufgezeichnet. Die Menge an F430 wurde mit einem molaren Extinktionskoeffizienten ε = 22.500 M−1 cm−1 bei 430 nm berechnet.

Für die F430-Extraktion wurde das gereinigte MCR mit einem gleichen Volumen 100 % Methanol behandelt und die ausgefällten Proteine ​​durch 5-minütige Zentrifugation bei 17.000 × g entfernt. Der Überstand, der freies F430 enthielt, wurde einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)-Analyse unter Verwendung einer C18-Säule (4,6 × 100 mm, 3,5 μm) auf einem Agilent 1260 Infinity System unterzogen, das mit einem Diodenarray-Detektor (DAD) VL+ ausgestattet war, wie zuvor beschrieben41 mit geringfügige Änderungen. Lösungsmittel A war 10 % Acetonitril und 0,5 % Ameisensäure in Wasser und Lösungsmittel B war 0,5 % Ameisensäure in 100 % Acetonitril. Die Flussrate betrug 0,5 ml/min und das Injektionsvolumen 30 μl. Die lineare Gradientenelution wurde auf folgende Weise angewendet: 0–10 % B über 25 Minuten, 10–100 % B über 5 Minuten. Das Spektrum wurde von 260 bis 640 nm aufgenommen. Die Quantifizierung basierte auf der mit authentischem F430 erstellten Standardkurve (ergänzende Abbildung S1).

Die gereinigten MCR-Untereinheiten wurden auf vorgefertigten 4–20 % SDS-PAGE-Gelen (Bio-Rad) getrennt und dann mit AcquaStain (Bulldog Bio) oder mit dem Pierce™ Silver Stain Kit (Thermo Fisher Scientific) gefärbt. Für den Trypsinverdau im Gel wurden die Gelbänder in kleine Stücke geschnitten und dann zweimal mit 50 % Acetonitril/20 mM Ammoniumbicarbonat (~pH 7,5–8) gespült. Die Gelstücke wurden durch Zugabe von 100 % Acetonitril dehydriert und in einem SpeedVac getrocknet. Verschiedene Mengen einer Trypsinlösung (0,01 µg µL−1 in 20 mM Ammoniumbicarbonat) wurden hinzugefügt, bis die Gelstücke die Lösung vollständig absorbierten. Die Proben wurden über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die tryptischen Peptide wurden aus Gelstücken durch zweimaliges Inkubieren mit 50 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure extrahiert. Die Extrakte wurden mit einem SpeedVac getrocknet. Ein ähnliches Protokoll wurde für den Pepsinverdau im Gel verwendet. Nachdem die Gelstücke zum Entfärben mit 50 % Acetonitril/20 mM Ammoniumbicarbonat gespült worden waren, wurden die Gelstücke vor der Dehydratisierung mit 100 % Acetonitril zweimal mit 0,1 % Ameisensäure gespült. Es wurde ausreichend Pepsinlösung (Promega, 0,02 mg mL−1 in 0,04 M HCl) zugegeben, um die Gelstücke zu bedecken. Die Proben wurden über Nacht (16–18 Stunden) bei 37 °C aufgeschlossen. Die Peptide wurden mit 50 % Acetonitril in Wasser extrahiert. Für den Trypsinverdau in Lösung wurden die Proben mit 20 mM Ammoniumbicarbonat auf 0,5–1 g L−1 verdünnt und mit Dithiothreitol in einer Endkonzentration von 10 mM ergänzt. Die Proben wurden 5–10 Minuten bei 100 °C inkubiert und dann auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Proteine ​​wurden dann mit Trypsin im Verhältnis 50:1, Protein zu Trypsin (Gew./Gew.), über Nacht bei 37 °C verdaut. Anschließend wurde die Probe in einer Vakuumfuge getrocknet.

Zur Proteinidentifizierung wurde der Peptid-Massenfingerabdruck (PMF) von Gelbanden mit einem Bruker Autoflex Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Time-of-Flight (TOF)-Massenspektrometer analysiert. Die Matrixverbindung 2,5-Dihydroxybenzoesäure (2,5-DHBA) wurde in 50 % Methanol gelöst, um eine Lösung von etwa 10 g L−1 herzustellen. Etwa 0,5–1 μl der Matrixlösung und der Probenlösungen (F430 und Tryptic-Peptide) wurden gemischt und auf einer Metallplatte abgelagert und vollständig trocknen gelassen.

Für PTM-Analysen und Quantifizierungen der relativen Häufigkeit chimärer MCR-Untereinheiten wurden die Analysen der Flüssigkeitschromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) auf einem Thermo Fisher LTQ Orbitrap Elite-Massenspektrometer in Verbindung mit einem Proxeon Easy NanoLC-System (Waltham, MA). Die Peptide wurden in 0,1 % Ameisensäure resuspendiert und dann in eine Umkehrphasensäule (selbstgepackte Säule/Emitter mit 200 Å 5 µM Bruker MagicAQ C18-Harz) geladen und dann direkt in das Massenspektrometer eluiert. Kurz gesagt, die Gradientenelution mit zwei Puffern (0,1 % Ameisensäure als Puffer A und 99,9 % Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure als Puffer B) begann mit 5 % B, wurde 2 Minuten lang bei 5 % B gehalten und dann auf 25 % B erhöht in 60 Min., auf 40 % B in 10 Min. und auf 95 % B in 10 Min. Zur Erfassung der MS-Daten wurde die Methode der datenabhängigen Erfassung (DDA) verwendet. Zuerst wurde ein Umfrage-MS-Scan erstellt und dann wurden die fünf besten Ionen im MS-Scan für die folgende CID- und HCD-MS/MS-Analyse ausgewählt. Sowohl MS- als auch MS/MS-Scans wurden von Orbitrap mit einer Auflösung von 120.000 bzw. 30.000 erfasst. Die Daten wurden mit der Xcalibur-Software (Version 2.2, Thermo Fisher Scientific) erfasst. Die Proteinidentifizierung und Modifikationscharakterisierung wurden mit Thermo Proteome Discoverer (Version 1.3/1.4/2.2) mit den Programmen Mascot (Matrix Science) oder SEQUEST (Thermo) durchgeführt. Die Spektren der modifizierten Peptide wurden weiter untersucht, um die Genauigkeit der Zuordnungen zu überprüfen. Zur Quantifizierung der relativen Häufigkeit wurden die chromatographischen Peakflächen der identifizierten Peptide, die zur gleichen MCR-Untereinheit gehören, extrahiert und kombiniert. Die relative Häufigkeit wurde durch direkten Vergleich der kombinierten Peakflächen berechnet (Supplemental Data 2).

Für die Massenspektrometrie intakter Proteine ​​wurde der gereinigte MCR in einer Konzentration von 10 μM in 200 mM Ammoniumacetat (pH 7,6) hergestellt. Die Spektren wurden mit einem 12 T Bruker Solarix FT-ICR-MS-Instrument aufgenommen. Die Probe wurde mittels Nano-Elektrospray mit 30 μm Quarzglas-Emitterspitzen (New Objective, Inc.) mit einer Durchflussrate von 300 nL/min in das Instrument eingebracht. Die Ionenoptik wurde für die Übertragung von Ionen mit hohem m/z-Wert optimiert, indem alle HF-Frequenzen auf ihre niedrigsten Werte eingestellt wurden (Oktupol 2,0 MHz, Kollisionszelle 1,4 MHz und Übertragung 1,0 MHz) und eine Flugzeit von 3 ms verwendet wurde. Die Spektren wurden mithilfe eines Savitzky-Golay-Filters in Bruker DataAnalysis geglättet. Ladungszustandszuordnungen und entfaltete Massen wurden manuell mit Standardtechniken bestimmt. Kurz gesagt, für jedes der gemessenen m/z-Verhältnisse wurde die Masse als Masse = (m/z)zz berechnet, wobei z die Ladung ist. Für Komplex I wurden die Peaks z von 28–32 zugeordnet. Für Komplex II wurden die Peaks z von 28–31 zugeordnet. Die gemeldeten Massen sind dann die Mittelwerte der Werte für jedes m/z-Verhältnis, und die Standardabweichung wurde aus der Variation der berechneten Massen berechnet.

Nach der Trennung der Proteine ​​auf vorgefertigten 4–20 % SDS-PAGE-Gelen (Bio-Rad) wurden sie auf Methanol-aktivierte Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen übertragen. Die unspezifische Bindung wurde mit 5 % Milch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung und 0,1 % Tween 20 (PBST) 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur blockiert. Die PVDF-Membranen wurden dann mit Primärantikörpern (1:1000-Verdünnung; Katalog-Nr. A8592, Sigma-Aldrich) gegen den FLAG-Tag 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und dreimal 15 Minuten lang mit PBST gewaschen. Anschließend wurden PVDF-Membranen unter Verwendung des Western-Meerrettich-Peroxidase-Substrats (HRP) für eine verbesserte Chemilumineszenz-Detektion entwickelt (Katalog-Nr. 32132; Thermo Fisher Scientific). Wie bereits berichtet47, wurde die relative Intensität jeder immunreaktiven Bande mit ImageJ geschätzt, wobei eine lineare Reaktion über den verwendeten Bereich bestätigt wurde.

Die RNA-Extraktion und die qRT-PCR wurden wie beschrieben durchgeführt47. Die Primer wurden auf der Grundlage der DNA-Sequenzen der mcrA- und ANME-1_G37-mcrB-Gene von M. maripaludis unter Verwendung der Thermo Fisher Primer Express-Software v3.0.1 mit einer Schmelztemperatur von 60 °C entworfen. Die Primersequenzen waren wie folgt: 5ʹ-GTTCACCCTTCCCTTGCATG-3ʹ (M. maripaludis mcrA-forward); 5ʹ-TGTTGATGTCGATTAAGAATCTGCT-3ʹ (M. maripaludis mcrA-reverse); 5ʹ-TCGTTAACCTGACCATTCGGA-3ʹ (G37 mcrB-vorwärts); 5ʹ-CCGCGGATTACCATTCCTTT-3ʹ (G37 mcrB-reverse). Standardkurven wurden mit 10-fachen Reihenverdünnungen zwischen 109 und 105 Kopien pro Reaktion erstellt. Für die qRT-PCR wurden für jede PCR-Reaktion 30 ng Gesamt-RNA verwendet. Alle Proben passten in die Standardkurve und die Amplifikationseffizienz betrug 97 % mit einem R2 von 0,99.

RosettaCM, eine verbesserte Methode zur vergleichenden Modellierung, wurde zum Erhalten der optimierten Strukturen48 verwendet. Der M. maripaludis MCR wurde unter Verwendung von MCRs von Methanopyrus kandleri (PDB-Code 1E6V), Methanosarcina barkeri (PDB-Code 1E6Y), Methanothermobacter thermautotrophicus (PDB-Code 1HBM), Methanothermobacter marburgensis (PDB-Code 3POT, 5A8R) und Methanothermobacter wolfeii (PDB-Code 5A8K) modelliert , 5A8W), ein unkultiviertes Archäon (PDB-Code 3SQG), Methanothermococcus thermolithotrophicus (PDB-Code 5N1Q), Methanotorris formicicus (PDB-Code 5N28) und Methermicoccus shengliensis (PDB-Code 7NKG) als Vorlagen. Die Modelle des ANME-2_HR1 McrG basierten auf MCRs von Methanosarcina barkeri MCR (PDB-Code 1E6Y), Methanothermobacter thermautotrophicus (PDB-Code 1HBM), Methanothermobacter marburgensis (PDB-Code 3POT, 5A8R), Methanothermobacter wolfeii (PDB-Code 5A8K, 5A8W), und Methermicoccus shengliensis (PDB-Code 7NKG) als Vorlagen. Lokale Docking-Suchen wurden mit RosettaDock (Rosetta Version 3.12)49,50 durchgeführt und eine Startstruktur wurde aus der vorgepackten Eingabestruktur mit zufälligen Gaußschen Störungen von 3 Å für die Translation und 8° für die Rotation generiert („-docking:dock_pert 3 8"). An die Standard-Rotamer-Bibliothek wurden zusätzliche chi1- und chi2-aromatische Rotamere („-ex1 -ex2aro“) angehängt. Die durch Ketten-IDs definierten Andockpartner stellten sicher, dass ANME McrG um das Trimer von M. maripaludis McrA, B und A' bewegt wurde. („-docking:partners ABD_C“). Bei jedem Andocklauf wurden etwa 60.000 Modelle hergestellt („-nstruct 60000“).

Eine Reihe von Messungen der strukturellen Genauigkeit werden regelmäßig zur Messung der Docking-Leistung verwendet, wie von den Critical Assessment of Protein Interactions (CAPRI)-Evaluatoren61 definiert. I_rmsd ist definiert als die mittlere quadratische Abweichung (RMSD) der schweren Atome in den Grenzflächenresten nach Überlagerung derselben Reste, wobei die Grenzfläche als alle Reste mit einem intermolekularen Abstand von höchstens 8 Å definiert ist. Wir klassifizierten unsere Andockergebnisse danach, ob sie einen Andocktrichter erreichten. Gemäß den von CAPRI definierten Kriterien galt ein Modell mit I_rmsd < 1,0 Å als hohe Qualität, 1,0 Å < I_rmsd < 2,0 Å als mittlere Qualität und 2,0 Å < I_rmsd < 4,0 Å als akzeptable Qualität. Die Strukturen wurden in PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.5, Schrödinger) betrachtet und angepasst.

Die Anzahl der Proben für jedes Experiment ist in den Abbildungslegenden und den Zusatzinformationen angegeben. Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism 9-Software durchgeführt und die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle im Rahmen dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind im Papier und in den Zusatzinformationsdateien verfügbar. Die im Manuskript verwendeten Original-Western-Blots und -Gele in voller Länge sind in der ergänzenden Abbildung S6 dargestellt. Rohdaten der Massenspektrometrie zur Quantifizierung der relativen Häufigkeit sind in den Zusatzdaten 2 enthalten. Rohdaten für die grafische Darstellung sind in den Zusatzdaten 3 enthalten. Auf die in dieser Studie verwendeten Plasmide kann in Addgene unter den Zugangscodes 192763, 192764, 192765, 192766 zugegriffen werden , 192767, 192768, 192769, 192770, 192771, 192772, 192773, 192774, 192775, 192776, 192777, 192778.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Steven Mansoorabadi (Auburn University) für wertvolle Diskussionen und Saw Kyin (Princeton Proteomics & Mass Spectrometry Facility) für einige der Protein-Massenspektrometrieanalysen. Die Plasmidkonstruktion und die bioinformatische Analyse wurden durch einen Zuschuss der ExxonMobil Research and Engineering Company an WBW und ECD unterstützt, und die Charakterisierung gereinigter Proteine ​​wurde durch einen Zuschuss des US-Energieministeriums (DE-SC0018028) an WBW und ECD unterstützt Die native Massenspektrometrieanalyse wurde durch ein Instrumentierungsstipendium 1S10 OD025118 unterstützt. Thermo Orbitrap Elite und FT-ICR wurden außerdem durch die Zuschüsse S10RR028859 und S10OD025118 an die Proteomics and Mass Spectrometry Facility der University of Georgia unterstützt.

Abteilung für Mikrobiologie, University of Georgia, Athens, GA, USA

Nana Shao und William B. Whitman

EMTEC IT, ExxonMobil Technical Computing Company, Annandale, NJ, USA

Yu Fan

Fakultät für Chemie, University of Georgia, Athens, GA, USA

Chau-Wen Chou, Robert V. Williams & I. Jonathan Amster

Abteilung für Chemie und Biochemie, Auburn University, Auburn, AL, USA

Shadi Yavari & Evert C. Duin

Energiewissenschaften, ExxonMobil Technology & Engineering Company, Annandale, NJ, USA

Stuart M. Brown & Yuchen Liu

Biomedizinische Wissenschaften, ExxonMobil Technology & Engineering Company, Annandale, NJ, USA

Ian J. Drake

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NS, YL, ECD und WBW haben die Forschung entworfen. NS führte Genetik- und Proteinreinigungs- und -charakterisierungsexperimente durch. CWC führte die meisten Protein-Massenspektrometrieanalysen durch. YF und SMB führten bioinformatische Analysen und Proteinstrukturmodellierung durch. SY führte das McrCmar-Pulldown-Experiment durch. RVW führte die Massenspektrometrie intakter Proteine ​​im Labor des IJAIJD durch und führte die qRT-PCR-Experimente durch. Alle Autoren analysierten die Daten. NS, YL und WBW haben das Manuskript geschrieben, das von allen Autoren bearbeitet wurde.

Korrespondenz mit William B. Whitman oder Yuchen Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Alfred Spormann, Jennifer Glass und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Zhijuan Qiu und Eve Rogers. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Shao, N., Fan, Y., Chou, CW. et al. Expression divergenter Methyl/Alkyl-Coenzym-M-Reduktasen aus nicht kultivierten Archaeen. Commun Biol 5, 1113 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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Eingegangen: 06. Mai 2022

Angenommen: 30. September 2022

Veröffentlicht: 20. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04057-6

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