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Aug 05, 2023

Entwicklung der Enzymfunktionalität im Flavin

Band Nature Communications

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 1042 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Unter den molekularen Anpassungsmechanismen in der Biologie ist die Diversifizierung der Enzymfunktion unverzichtbar. Indem es Organismen ermöglicht, ihr katalytisches Repertoire zu erweitern und grundlegend andere chemische Prozesse anzunehmen, können Tiere neu gefundene Substanzen und Xenobiotika, denen sie in neuen Umgebungen ausgesetzt sind, nutzen oder eliminieren. Hier untersuchen wir die flavinhaltigen Monooxygenasen (FMOs), die für die xenobiotische Entgiftung essentiell sind. Mithilfe eines paläobiochemischen Ansatzes in Kombination mit enzymologischen Techniken offenbaren wir die Reihe historischer Substitutionen, die für die funktionelle Diversifizierung der Familie bei Tetrapoden verantwortlich sind. Bemerkenswerterweise differenzieren einige Aminosäureaustausche ein angestammtes Multitasking-FMO in eine spezialisiertere Monooxygenase, indem sie das sauerstoffanreichernde Flavin-Zwischenprodukt modulieren. Unsere Ergebnisse untermauern die anhaltende Annahme, dass die enzymatische Funktion von einer Untergruppe von Resten abhängt, die nicht auf den Kern des aktiven Zentrums beschränkt ist.

Die flavinhaltigen Monooxygenasen (FMOs) sind Enzyme und Schlüsselkomponenten im Entgiftungsarsenal von Wirbeltieren1,2. FMOs sind allgemein für ihre Fähigkeit bekannt, heteroatomhaltige Moleküle in ihre wasserlöslichen, leicht ausscheidbaren Oxide umzuwandeln3. Im Gegensatz zu den spezifischeren Häm-haltigen Cytochrom-P450-Monooxygenasen4 können FMOs eine Vielzahl von Substraten in ihren aktiven Zentren aufnehmen5. Darüber hinaus katalysieren sie wichtige Schritte bei der Aktivierung entzündungshemmender und krebsbekämpfender Medikamente6,7 und sind an der endogenen Synthese essentieller Substanzen einschließlich Taurin beteiligt8. Für alle diese Oxidationen nutzen FMOs molekularen Sauerstoff (O2) und NADPH als Hydriddonor. Menschliche FMOs sind mit Krankheiten und Störungen verbunden, wobei Trimethylaminurie – allgemein bekannt als Fischgeruchssyndrom – das bekannteste Beispiel ist, das durch Mutationen in einem FMO-kodierenden Gen verursacht wird9,10.

Das menschliche Genom kodiert für fünf FMO-Paralogs (FMO1–5), wobei ein weiteres als Pseudogen (FMO6)11 beschrieben wird. Interessanterweise ist diese Fünf-Paralog-Anordnung bei praktisch allen Tetrapoden erhalten. Die FMOs 1–4 haben im Wesentlichen die gleichen katalytischen Eigenschaften, indem sie die für die Familie beschriebenen kanonischen Reaktionen durchführen: Sulfid- und Aminoxidationen (im Folgenden S/N oder Heteroatom)8,12. Im Gegenteil, FMO5 galt lange Zeit als „pseudoaktives“ FMO13. Erst im Jahr 2016 haben Fiorentini et al. zeigten, dass menschliches FMO5 in der Lage war, eine grundlegend andere Chemie durchzuführen, indem es ein Sauerstoffatom in die CC-Bindung von Ketonen und Aldehyden einfügte, eine Reaktion, die als Baeyer-Villiger-Oxidation (im Folgenden BV) bekannt ist14. Die beiden unterschiedlichen Chemien, S/N- und BV-Oxidationen, werden durch unterschiedliche katalytische Mechanismen erreicht, die durch ein gemeinsames sauerstoffanreicherndes reaktives Zwischenprodukt, das C4a-(Hydro)peroxyflavin, vermittelt werden, das in der FMO-Literatur oft als „gespannte Waffe“ definiert wird15,16 (Abb . 1). S/N-Oxidationen funktionieren über einen gemeinsamen elektrophilen Substitutionsmechanismus, bei dem das protonierte Flavin-Zwischenprodukt das elektronenreiche Substrat angreift15. Im Gegensatz dazu umfasst die BV-Reaktion die deprotonierte Form des C4a-Peroxyflavins unter Bildung eines tetraedrischen Addukts – des Criegee-Zwischenprodukts – zwischen dem sauerstoffbildenden Flavin-Zwischenprodukt und dem Substrat. Die BV-Oxygenierung erfordert anspruchsvolle strukturelle Voranordnungen im aktiven Zentrum, um die während der Katalyse gebildeten Spezies und die Wanderung eines Kohlenstoffzentrums aufzunehmen . Unsere früheren Arbeiten zur Rekonstruktion der FMOs von Säugetieren legen nahe, dass die unterschiedlichen S/N- und BV-Chemikalien bei Säugetieren bereits und vermutlich bei der Entstehung jeder Paralog-Gruppe definiert wurden, was die Existenz von zwei FMO-Varianten impliziert, von denen eine dem S/N gewidmet ist Oxidationen (FMO1–4) und die andere zu BV-Oxidationen (FMO5)18,19.

Die wiederkehrende Molekülstruktur stellt die Isoalloxazin-Einheit des FAD-Cofaktors dar, wobei R dem Ribityladenosin-Schwanz entspricht. E steht für Enzym. Zunächst wird oxidiertes FAD (E-FAD) durch NADPH reduziert. Das reduzierte Enzym (E-FADH2) reagiert leicht mit O2 und bildet das sauerstoffanreichernde Enzymzwischenprodukt C4a-Flavin(hydro)peroxid (E-FADOO(H)). Von hier aus sind zwei Mechanismen möglich, die S/N-Oxidation oder die BV-Oxidation, beide gefolgt von der anschließenden Freisetzung von H2O und NADP+. In Abwesenheit eines Substrats durchläuft das Enzym einen vergeblichen Wasserstoffperoxid-produzierenden Zyklus, der als Entkopplung bezeichnet wird.

Die Rekonstruktion der Ancestral Sequence (ASR) in Kombination mit biochemischen und biophysikalischen Methoden hat sich als wirksame Strategie zur Aufdeckung der historischen und physikalischen Ursachen der Proteinfunktion erwiesen20,21. Die Entwicklung von Strategien zum Umgang mit schädlichen und toxischen Substanzen ist für das Überleben aller Lebensformen von entscheidender Bedeutung. Aufbauend auf diesem Prinzip kamen wir zu dem Schluss, dass die Tetrapoden-FMOs eine aufschlussreiche Fallstudie wären, um zu erfahren, wie sich die Enzymfunktionalität im Laufe der Evolution diversifiziert (z. B. S/N vs. BV-Oxidationen). FMOs sind katalytisch komplexe Enzyme. Die Katalyse hängt von einer prosthetischen Gruppe (dem FAD), einem Co-Substrat (molekularer Sauerstoff), einem Elektronendonor (NADPH), dem Substrat und der Proteinmatrix ab (Abb. 1). In dieser Arbeit verfolgen wir die historischen Substitutionen, die gemeinsam das Zusammenspiel dieser vielen katalytischen Akteure optimieren22,23. Bei FMOs wird die funktionelle Vielfalt durch ein Netzwerk von Resten außerhalb des aktiven Zentrums verursacht, das die Bildung des sauerstoffanreichernden Flavin-Zwischenprodukts moduliert.

Die Evolutionsgeschichte von Wirbeltier-FMOs wurde durch Maximum-Likelihood- und Bayes'sche Methoden abgeleitet, wobei ein repräsentativer Datensatz verwendet wurde, der Sequenzen aller Landwirbeltiere und Knochenfische als externe Gruppe umfasste (ergänzende Abbildungen 1 und 2). FMOs entwickelten sich von einer Einzelkopie-Sequenz bei Wirbeltieren mit frühen Kiefern zu einer Anordnung mit fünf/sechs Paralogs bei Säugetieren und anderen großen Tierklassen. Wie wir bereits berichteten, fällt dieser Ausbruch der Paralogs mit dem Auftauchen von Tetrapoden zusammen18. Unter Berücksichtigung des Funktionsprofils von mAncFMOs18 und vorhandenen FMOs24 wurden die Aktivitäten der Kladen vorhergesagt (Abb. 2a). Dies bewies die Existenz zweier funktionell unterschiedlicher Flugbahnen vom gemeinsamen Vorfahren aller Tetrapoden FMO bis zu noch vorhandenen Paralogen. Man könnte sich drei gleichermaßen sparsame Hypothesen vorstellen, die die funktionelle Divergenz erklären: S/N- vs. BV-Oxidationen. Erstens war der Tetrapoden-Vorfahre nur in der Lage, Heteroatome mit Sauerstoff anzureichern, und die Fähigkeit zur Durchführung von BV-Oxidationen entwickelte sich innerhalb der FMO5-Klade. A priori wäre dies angesichts der kanonischen Aktivität von FMOs25 das wahrscheinlichste Szenario. Alternativ war der Vorfahre des Tetrapoden promiskuitiv und trug beide Aktivitäten, und nach dem Duplikationsereignis spezialisierten sich die Enzyme im Laufe der Zeit. Schließlich war der Tetrapoden-Vorfahre nur in der Lage, BV-Oxidationen durchzuführen, und nach einem Duplikationsereignis wurden die Änderungen, die S/N-Oxygenierungen ermöglichten, in die FMO1–4-Linie eingeführt.

a Zusammengebrochene Phylogenie von FMOs von Kieferwirbeltieren mit den Zielvorfahren an den Knoten: (1) tAncFMO1–5, (2) tAncFMO5, (3) tAncFMO1–4 und (4) tAncFMO1–3 (gelbe Kreise). Die Kladen sind basierend auf der Aktivität des Säugetiervorfahren gefärbt: S/N-Oxidation (blau), BV-Oxidation (orange). Für die FMO4-Aktivität liegt keine experimentelle Bestätigung vor. Die abgebildeten Silhouetten stellen den angestammten Tetrapoden (von Dmitry Bogdanov (vektorisiert von T. Michael Keesey) unter CC BY-SA 3.0) und Actinopterygii (Rochenflosser) dar. Die Maßstabsleiste stellt die Ersetzungen pro Standort dar. b Steady-State-Kinetik für tAncFMO1–4 in Richtung NADPH (rote Linie, KM = 15,7 ± 1,8 μM) und NADH (blaue Linie, KM = 90 ± 17,6 μM). Als Substrat wurde Methyl-p-tolylsulfid (MPTS) verwendet. Die beobachteten Raten wurden durch Verfolgen der Absorptionsänderung bei 340 nm erhalten. Die Daten werden als Mittelwerte dargestellt und die Fehlerbalken entsprechen der Standardabweichung (n = 3 unabhängige Experimente). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. c Konvertierungstests mit den drei Substratsätzen zum Testen der S/N- und BV-Oxidationsaktivitäten. In die Analyse wurden angestammte FMOs von Säugetieren (mAncFMO18,19) einbezogen. Balken stellen mittlere Konversionswerte dar und Punkte die Werte für jedes Experiment (n = 2 unabhängige Experimente). S/N-Oxidationen sind in Blau dargestellt, während BV-Oxidationen in Orange dargestellt sind. Die Quelldaten finden Sie in der Ergänzungstabelle 4.

Um den Weg zur funktionalen Divergenz zu verstehen, beschlossen wir, die Vorfahren vor und unmittelbar nach der Familienerweiterung wiederzubeleben. Vier Knoten wurden speziell für ihre experimentelle Charakterisierung ausgewählt: tAncFMO1–5, tAncFMO5, tAncFMO1–4 und tAncFMO1–3 (Abb. 2a). Es wurde festgestellt, dass alle Vorfahren die gleiche Länge hatten (532 Aminosäuren) und mit hoher Sicherheit rekonstruiert wurden (Gesamt-Posteriori-Wahrscheinlichkeiten (\(\overline{{PP}}\)) > 0,94) (Ergänzende Abbildung 3). tAncFMO1-5 (\(\overline{{PP}}\) = 0,95) ist der Vorfahre vor dem ersten Duplikationsereignis (einschließlich aller Tetrapoden-FMO-Paralogs), während tAncFMO5 (\(\overline{{PP}}\) = 0,96 ) und tAncFMO1–4 (\(\overline{{PP}}\) = 0,94) sind seine Tochterparaloge, Vorfahren jeder funktionell vielfältigen Abstammungslinie. Innerhalb der FMO1–4-Klade kam es zu weiteren Duplikationsereignissen. Das erste davon entstand in der FMO4-Klade und tAncFMO1–3 (\(\overline{{PP}}\) = 0,95), das ebenfalls wiederbelebt wurde. Aus diesem Vorfahren (tAncFMO1–3) ging als nächstes die FMO2-Gruppe hervor, gefolgt von FMO1 und FMO3, wobei letztere sich ausschließlich bei Säugetieren weiter verdoppelten, um FMO6, ein Pseudogen beim Menschen, hervorzubringen21. Da das Ziel der ASR darin besteht, den Phänotyp ausgestorbener Moleküle und nicht ihre genaue Sequenz wiederherzustellen, muss die Unsicherheit bei der Rekonstruktion berücksichtigt werden26. Daher wurden auch die alternativen Vorfahrensequenzen (Alt_tAncFMOs) ermittelt. Diese zeigen die Kombination der zweitbesten Zustände an allen mehrdeutig rekonstruierten Standorten27 (siehe Methoden).

Alle ausgewählten Knoten konnten als membrangebundene Proteine ​​​​exprimiert werden und zeigten nach der Reinigung die typischen spektralen Eigenschaften flavinhaltiger Enzyme (ergänzende Abbildung 4). Die Vorfahren zeigten sehr gute thermische Stabilitäten (\(\bar{{T}_{m}}\) \(\sim\) 60 °C, Ergänzungstabelle 1), vergleichbar mit denen von Säugetier-AncFMOs19. Allerdings hatte die Anwesenheit des oxidierten Coenzyms NAD(P)+ in diesem Fall keinen Einfluss auf die Tm-Werte. Zunächst haben wir bestätigt, dass die wiederbelebten tAncFMOs die kinetischen Eigenschaften aufwiesen, die für ein typisches Tetrapoden-FMO erwartet werden. Beispielsweise zeigte tAncFMO1–4 ein typisches Michaelis-Menten-Verhalten gegenüber dem Modellsubstrat Methyl-p-tolylsulfid (katalytische Effizienz (kcat/KM) = 0,98 s−1 mM−1; ergänzende Abbildung 5) und eine klare Selektivität für NADPH als Hydriddonor über NADH (Abb. 2b). Es wurde festgestellt, dass ihre O2-Affinitäten (KMO2) im niedrigen mikromolaren Bereich liegen, was auf eine effiziente Fähigkeit zur Sauerstoffnutzung schließen lässt (ergänzende Abbildung 6, ergänzende Tabelle 2). Obwohl die wiederbelebten Enzyme NADPH und NADH als Elektronendonoren in der Entkopplungsreaktion verbrauchen konnten (Ergänzungsabbildung 7, Ergänzungstabelle 2), wurden bei Verwendung von NADH im Vergleich zu NADPH deutlich geringere Oxygenierungen erreicht (z. B. tAncFMO1–4 + NADH = 15). % Substratumwandlungen, tAncFMO1–4 + NADPH = 100 % Umwandlungen; ergänzende Abbildung 8). Diese Coenzym-Abhängigkeit steht im Einklang mit dem Übergewicht von NADPH in den antioxidativen zellulären Abwehrsystemen28 und untermauert, dass die Identität des Nicotinamid-Cofaktors eine entscheidende Rolle bei der Definition der Enzymfunktionalität spielt. Als nächstes wurde ihr katalytisches Verhalten anhand einer Reihe prototypischer Substrate bewertet, um die Fähigkeit zur Durchführung von S/N- und BV-Oxidationen zu überprüfen (Abb. 2c; ergänzende Abbildungen 9 und 10, ergänzende Tabellen 3 und 4). Wir beobachteten, dass die Vorfahren jeder Abstammungslinie die gleichen Aktivitäten hatten wie ihre Nachkommen. Insbesondere führten tAncFMO1–4 und tAncFMO1–3 ausschließlich S/N-Oxidationen durch, während tAncFMO5 die BV-Oxidation aller drei getesteten Ketone mit teilweiser oder keiner Umwandlung der heteroatomhaltigen Substrate katalysierte. Im Gegensatz dazu wurde festgestellt, dass der Vorläufer tAncFMO1–5 vor der Duplikation alle drei Arten von Substraten oxidiert und sowohl als S/N- als auch als BV-Oxygenierungsenzym aktiv ist. Um die Robustheit der Rekonstruktion zu bestätigen, wurden auch alternative Vorfahren wiederbelebt (Ergänzungstabelle 5). Sie alle zeigten den gleichen Phänotyp wie die jeweiligen tAncFMOs (Ergänzungstabelle 4). Diese Ergebnisse führten zu einer kritischen Schlussfolgerung: Der Vorfahr aller Tetrapoden-FMO-Paralogs (tAncFMO1–5) war ein bifunktionelles Enzym, das sowohl BV- als auch S/N-Oxidationen durchführen konnte.

Im Hinblick auf Fitnesslandschaften im Sequenzraum können die vielfältigen katalytischen Aktivitäten von tAncFMO1–5 als zwei überlappende Peaks interpretiert werden, die den oxidativen Aktivitäten von BV und S/N entsprechen (Abb. 3a). Während das Tochterparalog tAncFMO1–4 einen einzelnen Peak behielt, nachdem es die Fähigkeit zur Durchführung von BV-Oxidationen verloren hatte. Um die Sequenzdeterminanten der BV- vs. S/N-Funktionalitäten zu analysieren, wurde eine Mutationsstrategie entwickelt, bei der einige der historischen Substitutionen von tAncFMO1–4 rückgängig gemacht wurden, um die BV-Oxidationsaktivität wiederherzustellen. Strukturmodelle von tAncFMO1–5 und tAncFMO1–4 wurden durch Homologiemodellierung unter Verwendung von YASARA29 unter Verwendung von mAncFMO5 (PDB:6SEK) als Vorlage und AlphaFold230 erstellt (ergänzende Abbildung 11). Unter Berücksichtigung der Tatsache, dass an der Verzweigung, die beide Vorfahren verbindet, 45 Substitutionen auftraten, identifizierten wir die „revertierenden“ Mutationen basierend auf (i) der Wahrscheinlichkeit des MAP-Zustands (maximum a posteriori) für die betrachtete Stelle in der Rekonstruktion, (ii) dem Grad der Konservierung in einem Mehrfachsequenz-Alignment von Heteroatom-oxygenierenden FMOs und (iii) deren strukturelle Lage. In einer ersten Analyserunde wurden tAncFMO1–4-Mutanten mit 4, 12 und 16 Substitutionen hergestellt, die im aktiven Zentrum, in den Substrat-/Produkttunneln, in der Nähe von FAD und in der ersten oder zweiten Resthülle um NADPH vorhanden sind (Abb . 3b, Ergänzende Abb. 12). Die 16×- und 12×-Mutanten zeigten eine geringe, aber signifikante Aktivität für das BV-Substrat Phenylaceton. Dennoch zeigte die 4×-Mutante das gleiche katalytische Profil wie tAncFMO1–4 (Abb. 3c). Daher wurde eine weitere Untergruppe von 4 Substitutionen ausgehend von der 12×-Mutante entworfen, wobei der Schwerpunkt auf der strikten Erhaltung der in der FMO5-Linie gefundenen Reste und der Frage lag, ob bestimmte Aminosäuren an Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen beteiligt waren. Diese Mutante mit der Bezeichnung 4′× war in der Lage, BV-Oxidationen in geringen, aber dennoch signifikanten Mengen zu katalysieren und gleichzeitig ihre Aktivität gegenüber S/N-Oxidationen beizubehalten. Um herauszufinden, welche dieser Substitutionen für die BV-Oxidation erforderlich sind, wurden Einzel-, Doppel- und Dreifachmutanten getestet (Abb. 3d). Es zeigte sich eine positive Synergie zwischen I60, H275 und H426, da jede einzelne Mutante ausschließlich S/N-Oxidationen katalysierte, während die Ketonoxidation nur wiederhergestellt wurde, wenn diese drei Substitutionen kombiniert wurden. Darüber hinaus schien die vierte Substitution (N222) eine nachteilige Rolle zu spielen, da ihre Einbeziehung zu geringeren Umsätzen bei BV-Oxidationen führte. Interessanterweise befindet sich nur I60 im aktiven Zentrum. Seine hydrophobe Seitenkette ist hinter der Substratbindungstasche versteckt, in unmittelbarer Nähe der Si-Fläche des Isoalloxazinrings (Abb. 4). H275 und H426 befinden sich stattdessen an der Peripherie des Proteins, 3–7 Å vom Coenzym NADP+ entfernt (Abb. 4b, c). Wahrscheinlich sind diese beiden Reste an einem Wasserstoffbrückenbindungsnetzwerk beteiligt, das durch oberflächengebundene Wassermoleküle vermittelt wird, wobei sich das Dinukleotid in seiner Bindungstasche befindet (Abb. 4d, e). Aus dieser strukturellen Erkenntnis scheint klar zu sein, dass das Interaktionsnetzwerk, das für die BV-Oxidationsaktivität in 3×-tAncFMO1–4 verantwortlich ist, über gekoppelte Wechselwirkungen mit den NADP+- und FAD-Cofaktoren vermittelt wird. Diese Art der Interaktion wurde als durch den Liganden vermittelte Epistase katalogisiert und gilt als das komplizierteste Substitutionsnetzwerk, das für die Enzymfunktion etabliert wurde31.

ein Schema, das die umgekehrte Mutationsstrategie in Bezug auf Funktionalitäten als Landschaften im Sequenzraum darstellt23. b Liste der in jeder der konstruierten Varianten mutierten Stellen. Die nachfolgenden Mutationsrunden werden in Graustufen dargestellt. c Durch tAncFMO1–4-Mutanten katalysierte Umwandlungen und d Zerlegung von 4′×-tAncFMO1–4. Balken stellen mittlere Konversionswerte dar und Punkte die Werte für jedes Experiment (n = 2 unabhängige Experimente). Die Quelldaten finden Sie in der Ergänzungstabelle 4.

ein Modell von tAncFMO1–4 mit 4′× (I60T, N222S, H275N, H426N) Resten, dargestellt in Grün. b, c Fokussierte Ansichten mit markierten 4′×-Resten. Die Abstände zwischen einem H am Cγ1 der I60-Seitenkette und dem O am C4 des FAD (2,6 Å) und zwischen dem Nε2 von H275 und dem Cε1 von H426 mit zwei O-Atomen der Phosphateinheit von NADP+ (6,7 und 3,3 Å) werden angezeigt. d Wasserstoffbrückenwechselwirkungen für I60 sind in Hellblau dargestellt. e Wasserstoffbrückenbindungswechselwirkungen für H275 und H426 sind in Hellblau dargestellt. Die Sekundärstruktur und die Reste von tAncFMO1–5 sind violett dargestellt. FAD- und NADP+-Moleküle sind in Gelb bzw. Blau dargestellt.

Das Ergebnis der Mutationsanalyse warf Fragen hinsichtlich der mechanistischen Grundlage für die funktionelle Spezialisierung von Tetrapoden-FMOs auf. Um dieses Problem anzugehen, müssen wir zunächst ein charakteristisches Merkmal dieser Enzyme zur Kenntnis nehmen: die Doppelrolle, die NADPH spielt. Der Cofaktor reduziert zunächst das Flavin und durchläuft dann eine Konformationsänderung, um seine Carbamidgruppe in der Wasserstoffbrückenbindungsentfernung zum N5-Atom des Flavins zu positionieren. In dieser Konformation fördert NADP+ entscheidend die Bildung des Flavin-(Hydro)peroxids aus der Reaktion des reduzierten Flavins mit molekularem Sauerstoff. Somit ist NADPH sowohl der Elektronendonor als auch ein integrales katalytisches Element, das für die Sauerstoffanreicherung des Substrats unerlässlich ist. Vor diesem mechanistischen Hintergrund wollten wir zunächst die Reaktivität von tAncFMO1–5 und tAncFMO1–4 mit NADPH untersuchen. Mithilfe schneller kinetischer Analysen haben wir herausgefunden, dass beide Enzyme durch NADPH unter anaeroben Bedingungen reduziert werden (kred = 0,0097 ± 1,2 × 10−4 s−1 für tAncFMO1–5 und 0,25 ± 0,016 s−1 für tAncFMO1–4) (Ergänzende Abb. 13). Die anaerob NADPH-reduzierten FMOs wurden dann verwendet, um die Reaktivität der Enzyme mit O2 (0,62 mM) zu untersuchen. Sowohl tAncFMO1–5 als auch tAncFMO1–4 reagierten mit Sauerstoff mit ähnlichen Geschwindigkeiten (kox = 1,5 ± 0,1 s−1 für tAncFMO1–5 und 3,2 ± 0,11 s−1 für tAncFMO1–4) in einem typischen zweistufigen Prozess, bei dem der erste Schritt ergab eine Spezies mit spektralen Eigenschaften, die mit denen für ein C4a-(Hydro)peroxyflavin (λmax = 380 nm)32 übereinstimmten (Abb. 5, ergänzende Abb. 14).

Die Spektren wurden rechtzeitig aufgezeichnet, um die Reaktion von reduziertem tAncFMO1–4 mit molekularem Sauerstoff in einer Stopped-Flow-Apparatur zu überwachen. Es werden repräsentative Experimente gezeigt (n = 3 unabhängige Experimente). Der Einschub oben links zeigt die entfalteten Spektren, die in einen zweistufigen Prozess \(a\mathop{\to }\limits^{{k}_{1}}b\mathop{\to }\limits^{{k} _{2}}c\) mit k1 = 3,2 ± 0,11 s−1 und k2 = 0,0065 ± 0,0001 s−1. Der obere rechte Einschub zeigt die Änderung der Absorption zwischen Spezies a (E-FADH2) und b (E-FADOO(H)). Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Eine mechanistisch entscheidende Frage betrifft den Protonierungszustand des reaktiven Zwischenprodukts, wobei die protonierte Form hauptsächlich der S/N-Oxidation zugeschrieben wird und die deprotonierte Form stattdessen die BV-Oxidation bewirkt17. Die bahnbrechende Arbeit von Masseys Gruppe zur Cyclohexanonmonooxygenase zeigte, dass die Spektren des deprotonierten und des protonierten Flavin-(Hydro)peroxids unterschiedlich sein können, da die Deprotonierung zu einer Blauverschiebung des Absorptionspeaks führen würde33. Die Stopped-Flow-Experimente zeigten keinen deutlichen Unterschied in den Zwischenspektren von tAncFMO1–5 und tAncFMO1–4 (Abb. 5, ergänzende Abb. 14). Protonierungsbedingte Veränderungen in den Flavin-(Hydro)peroxid-Spektren könnten daher enzymspezifisch und/oder zu klein sein, um an diesen Enzymen messbar zu sein. Es ist auch möglich, dass die funktionelle Vielfalt beider Vorfahren auf andere Faktoren und nicht nur auf die Zwischenprotonierung zurückzuführen ist. Unter der Annahme eines pKa-Werts von etwa 8 für das Flavin-(hydro)peroxid33,34 wird die Enzympopulation teilweise protoniert und teilweise deprotoniert sein und unter unseren Testbedingungen möglicherweise sowohl S/N- als auch BV-Oxidationen durchführen können. tAncFMO1–5 und tAncFMO5 sind tatsächlich zu beiden Reaktionen fähig (Abb. 2c).

Einen Hinweis liefert die dreifache T60I-, N275H- und N426H-Mutante, die die BV-Aktivität in tAncFMO1–4 wiederherstellt. Die experimentelle Charakterisierung dieser Variante zeigte ähnliche spektrale Merkmale und kinetisches Verhalten wie tAncFMO1–4 (Ergänzende Abbildungen 15 und 16). Keine dieser Mutationen allein reicht aus, um die BV-Funktionalität zu installieren. Stattdessen müssen alle drei Mutationen gleichzeitig vorhanden sein. H275 und H426 führen positiv geladene Stellen in die Reste der ersten und zweiten Schale ein, die das NADP+ umgeben. I60 befindet sich physikalisch in der Nähe von N61, einem streng konservierten und essentiellen Rest, der über dem Flavin N5 und der nahegelegenen Carbamidgruppe von NADP+ 35,36 hängt (ergänzende Abbildung 17). Die Kombination dieser Reste könnte daher die Elektrostatik rund um das katalytische Zentrum leicht stören und die lokale Dynamik des fest gebundenen und katalytisch wichtigen NADP+ feinabstimmen. Infolgedessen könnten die T60I-, N275H- und N426H-Mutationen die BV-Katalyse ermöglichen, indem sie elektrostatisch die Bildung des negativ geladenen Criegee-Zwischenprodukts begünstigen und dem aktiven Zentrum die für die Kohlenstoffatommigration erforderliche Anpassungsfähigkeit verleihen.

In dieser Arbeit werfen wir mithilfe eines historischen Ansatzes Licht auf die Entstehung und Entwicklung der Katalyse in tierischen FMOs. Die Flugbahn der FMO-Familie bei Tetrapoden wurde funktionell zerlegt. Als Ergebnis gibt es zwei bemerkenswerte Aspekte, die diskutiert werden müssen; eines betraf die Katalyse in nukleotidabhängigen Enzymen und das andere bezog sich auf die Biologie von Organismen.

FMOs sind Enzyme, die selektive Oxygenierungen durch die präzise abgestimmte Wirkung mehrerer katalytischer Elemente katalysieren. Es ist seit langem bekannt, dass der Hydriddonor (NADPH) eine entscheidende Rolle spielt, da er während des gesamten Katalysezyklus gebunden bleibt und seine Freisetzung häufig die Katalysegeschwindigkeit bestimmt33. Die strukturelle Grundlage des Einflusses des Hydriddonors auf die Art der Oxygenierungsreaktion ist jedoch weiterhin unbekannt. Ebenso sind die für die FMO-Familie definierten archetypischen Reaktionen Oxidationen heteroatomhaltiger Moleküle11. Die Tatsache, dass das menschliche FMO5 nachweislich BV-Oxidationen durchführt, war zweifellos ein Paradigmenwechsel im Verständnis dieser Enzymfamilie14. Durch die Erforschung des Evolutionspfads von FMOs bei Wirbeltieren mit Kiefern konnten wir diese beiden faszinierenden Aspekte der Katalyse von FMOs verstehen. Dabei haben wir als Hauptansatz die Rekonstruktion der Ahnensequenz und enzymologische Techniken genutzt. FMOs führen über epistatische Wechselwirkungen zwischen distalen Substitutionen im aktiven Zentrum, vermittelt durch die Nukleotid-Cofaktoren FAD und NADP+, zwei grundsätzlich unterschiedliche chemische Prozesse aus: S/N- und BV-Oxidationen. Die Sequenzdeterminanten dieser beiden Enzymfunktionalitäten schließen sich nicht gegenseitig aus, da beide im selben Proteinkern koexistieren können, wie für das multifunktionale Ur-FMO (tAncFMO1–5) gezeigt wurde. Dies eröffnet die Möglichkeit, die BV-Aktivität als kanonisch für die Proteinfamilie zu betrachten. Dies muss noch ermittelt werden, bis weitere FMOs aus anderen taxonomischen Gruppen systematisch als Säugetier-FMOs charakterisiert werden8,14,18,19,37,38. Daraus lassen sich zwei grundlegende Schlussfolgerungen ziehen: (i) Bei nukleotidabhängigen Monooxygenasen ist die Funktionalität das Ergebnis komplexer Wechselwirkungen zwischen den funktionellen Substitutionen, die das interne katalytische Netzwerk, die Identität des Hydriddonors und des Substrat/O2-Paares festlegen, und ( ii) Eine Enzymspezialisierung kann durch unwahrscheinliche Mutationen erfolgen, die nicht direkt auf die katalytischen Reste abzielen, sondern vielmehr das feine Gleichgewicht der Wechselwirkungen und die Strukturdynamik des Enzyms verändern.

Was den biologischen Aspekt der Organismen betrifft, hat unsere Analyse ergeben, dass sich alle vorhandenen Tetrapoden-FMOs aus einem angestammten Enzym entwickelt haben, das sowohl BV- als auch Heteroatom-Monooxygenierungen durchführte. Dieser Befund legt nahe, dass die BV-Aktivität in der Vergangenheit möglicherweise überlebenswichtig war und nicht das Ergebnis eines Neofunktionalisierungsereignisses ist. Die beobachtete funktionelle Divergenz in modernen FMO-Paralogs ist das Ergebnis eines funktionellen Optimierungsprozesses durch Genduplikation im Einklang mit dem Innovation-Amplification-Divergence-Modell (IAD) . Nach dem ersten Duplikationsereignis behielt die FMO5-Linie die enzymatische Funktion des Vorfahren vor der Duplikation bei und die BV-Oxidationsaktivität bleibt in modernen Arten bestehen14. Die FMO1–4-Linie ist funktionell auf die Sauerstoffanreicherung heteroatomhaltiger Moleküle optimiert und durch aufeinanderfolgende Genduplikationen spezialisiert. Wir gehen davon aus, dass der Übergang von Knochenwirbeltieren zu Tetrapoden mit Umweltproblemen verbunden war40 (Ernährung, Koexistenz mit Landpflanzen, Exposition gegenüber höherer O2-Konzentration usw.), die die Expansion und Diversifizierung der FMO-Familie auslösten. Über eine ähnliche Idee wurde in der Vergangenheit vage spekuliert, was der für CYPs41 vorgeschlagenen Idee entspricht, da FMOs in der Lage sind, pflanzliche Metaboliten in weniger toxische Substanzen umzuwandeln42. Diese Hypothese wird durch das Vorhandensein nur einer einzigen FMO-Kopie in Knochenfischen gestützt. Die Zahl der FMOs nahm mit der Zeit zu und ihre Funktionalität wurde vielfältiger, wodurch Tetrapoden ein äußerst vielseitiges Entgiftungssystem erhielten, das in der Lage war, Heteroatom- und Carbonyl-haltige Verbindungen umzuwandeln.

Die FMO-Phylogenie von Tetrapoden wurde unter Verwendung unseres zuvor veröffentlichten Datensatzes als Quelle konstruiert. Der Datensatz wurde wie folgt verstärkt: (i) Zuvor experimentell charakterisierte FMO-Sequenzen von Homo sapiens wurden als Abfragen bei BLASTp-Suchen in nichtredundanten GenBank-Proteinsequenzen (nr) und in Uniprot KB verwendet. Die Suche wurde durch die Taxonomie der Organismen nach Klassen oder Ordnungen eingeschränkt, die darauf abzielte, die gesamte FMO-Vielfalt der Landwirbeltiere (d. h. Amphibien-, Aves-, Crocodylia-, Lepidosauria- und Mammalia-Klassen und Testudines-Reihenfolge) zu untersuchen, die von der TimeTree-Wissensdatenbank43 geleitet wurde. Knochenfischgruppen wie Actinopterygii, Cladistia und Chondrichthyes wurden ebenfalls abgebaut, um Sequenzen für die Wurzel zu sammeln. (ii) Teilsequenzen oder Sequenzen mit geringer Qualität (wie durch NCBI44 definiert) wurden ausgeschlossen. (iii) Alle gesammelten Sequenzen wurden in einem Multiple Sequence Alignment (MSA) mit MAFFT v745 gesammelt und analysiert, wobei diejenigen entfernt wurden, die mehr als einmal gesammelt wurden. Sequenzen, die echten ORFs entsprechen, wurden im Datensatz gespeichert (bei Bedarf wurde dies durch reziproke tBLASTn-Suchen bestätigt). Dieser Prozess stellte die Erstellung eines repräsentativen und nicht redundanten Datensatzes sicher. Dazu gehörten jeweils 35, 272, 77, 55, 31 und 66 FMO-Homologe von Amphibien, Säugetieren, Vögeln, Reptilien, Hodentieren und Knochenfischen. Das MSA enthielt 536 Sequenzen (613 Stellen) und wurde manuell auf einzelne Sequenzerweiterungen (537 Stellen) zugeschnitten (Ergänzungsdaten 1). Die am besten geeigneten Modellparameter (JTT-Substitutionsmatrix und α = 1,114) wurden durch das Akaike-Informationskriterium in ProtTest v3.446 ermittelt. Die Phylogenie wurde durch die Maximum-Likelihood-Methode in RAxML v8.2.10 (HPC-PTHREADS-Modul)47 abgeleitet. Die Robustheit der Topologie wurde durch die Ausführung von 500 nichtparametrischen Bootstraps bewertet und diese wurden später in BOOSTER48 der Transfer Bootstrap Expectation (TBE) unterzogen. Auch die Phylogenie wurde in Mr. Bayes v3.2.649 abgeleitet, indem 2.000.000 Generationen durchlaufen wurden, bis eine Konvergenz <0,2 (bestimmt durch die Standardabweichung der Teilfrequenzen) erreicht wurde. Zur Visualisierung und Bearbeitung der Bäume wurde Figtree v1.4.2 verwendet. Die Rekonstruktion der Ahnensequenz wurde in PAMLX v.4.9 als Randrekonstruktion unter Verwendung des CODEML-Moduls50 durchgeführt. Die Sequenzen wurden unter Verwendung einer empirischen Substitutionsmatrix, einer empirischen Gleichgewichtsaminosäurehäufigkeit (Modell = 3), 4 Gammakategorien (α = 1,114) und einer Jones-Substitutionsmatrix analysiert. Die hintere Wahrscheinlichkeitsverteilung der Vorfahrenstaaten an jedem Standort wurde an Knoten analysiert, die tAncFMO1–5, tAncFMO5, tAncFMO1–4 und tAncFMO1–3 entsprachen. Die Länge der Vorfahren wurde durch sparsame Analyse des Vorhandenseins/Fehlens von Lücken in den Zielknoten auf der Grundlage der Länge der abgeleiteten Sequenzen in jeder Gruppe behandelt (Fitch-Algorithmus)26. Standorte galten als mehrdeutig rekonstruiert, wenn die Alternativzustände A-posteriori-Wahrscheinlichkeiten (PP) > 0,2 aufwiesen. Die Sequenzen der alternativen Vorfahren (Alt_tAncFMOs) wurden generiert, indem insgesamt die zweitbesten Zustände für die mehrdeutig rekonstruierten Standorte plus die MAP-Zustände (PP > 0,8) einbezogen wurden.

Das Design der Mutanten basierte auf einer bioinformatischen Analyse, die drei Hauptkomponenten umfasste: (i) die Genauigkeit der Rekonstruktion pro Standort, (ii) den Erhaltungsgrad jedes Standorts und (iii) die strukturelle Umgebung jedes Standorts. Zunächst wurden die 45 Substitutionen an der Verzweigung, die tAncFMO1–5 mit tAncFMO1–4 verbindet, aufgelistet und bei der Rekonstruktion auf ihre PP untersucht. Diejenigen, die an beiden Knoten einen PP > 0,8 aufwiesen, wurden für den nächsten Schritt ausgewählt, da diese als echte Substitutionen galten. Wenn an einem der Knoten die untersuchte Stelle mit einem PP < 0,8 rekonstruiert wurde und der alternative Zustand (PP > 0,2) sich vom MAP-Zustand am anderen Knoten unterschied, wurde er in die Auswahl einbezogen. Durch diesen ersten Prozess konnten wir die Anzahl der zu untersuchenden Substitutionen auf 27 reduzieren. Anschließend wurde der Erhaltungsgrad für jeden der ausgewählten Standorte mithilfe des ConSurf-Servers51 analysiert. Die Stellen, die entweder im gesamten Datensatz oder nur in der Heteroatom-oxidativen Abstammungslinie oder der BV-Abstammungslinie als konserviert identifiziert wurden, wurden weiter ausgewählt. Schließlich wurde die strukturelle Umgebung jedes Standorts untersucht, wobei die Strukturen von mAncFMO5 (PDB 6SEK) als Modell für die BV-Linie und von mAncFMO2 (PDB 6SF0) als Modell für die Heteroatom-Oxidationslinie verwendet wurden. Sechzehn Standorte wurden als Kandidaten für experimentelle Tests identifiziert. Diese Standorte wurden entsprechend ihrer Nähe zum aktiven Standort und/oder ihrem Erhaltungsgrad weiter in drei Untergruppen unterteilt. Somit umfasste 4× 4 Substitutionen an der aktiven Stelle, 12× umfasste die Substitutionen von 4× plus 8 Stellen und 16× umfasste alle ausgewählten Stellen.

Die dreidimensionale Struktur von tAncFMO1–5 und tAncFMO1–4 wurde mit AlphaFold230 unter Verwendung der casp14/full_dbs-Einstellungen modelliert. Außerdem wurden Strukturmodelle mit YASARA29 und 6SEK als Vorlage erstellt. Diese enthielten die FAD- und NADPH-Cofaktoren im aktiven Zentrum. Strukturen wurden mit ChimeraX 1.2.5 und PyMOL 2.5.2 untersucht. zur Rationalisierung von Mutationen, die für die Einführung der Baeyer-Villiger-Oxidation von Vorteil sein könnten. Rückstände wurden in drei Gruppen eingeteilt, je nachdem, ob sie in den FAD- und NADPH-bindenden Domänen oder in der 80-Reste-Insertion vorhanden waren, von der zuvor gezeigt wurde, dass sie für die Bildung des Substrattunnels von grundlegender Bedeutung ist. Nach der Kategorisierung wurden die Rückstände entweder als „Oberfläche“ oder „Kern“ zugeordnet (ergänzende Abbildung 12). Dieser Schritt trug dazu bei, Rückstände schnell zu entfernen, die wahrscheinlich keine Rolle bei der Veränderung der Funktion spielten. Alle verbleibenden Rückstände wurden aufbewahrt und unter Verwendung der oben genannten Strategie der umgekehrten Mutation ausgewertet.

Escherichia coli NEB10β-Zellen (Kat.-Nr. C3019I), DpnI (Kat.-Nr. R0176L) und BsaI-HF V2 (Kat.-Nr. R3733S) stammten von New England Biolabs. T4-DNA-Ligase (Kat.-Nr. EL0013) wurde bei Thermo Fisher Scientific bestellt. NADPH (Kat.-Nr. 44335000) wurde bei Oriental Yeast Co. bestellt. Tamoxifen-N-oxid (Kat.-Nr. FT27997) und Benzydamin-N-oxid (Kat.-Nr. FB18263) wurden von Biosynth bezogen und alle anderen Chemikalien stammten von Sigma-Aldrich.

Synthetische Gene, die BsaI-Restriktionsstellen sowohl am 5′- als auch am 3′-Ende enthalten, wurden bei Twist Bioscience oder bei Integrated DNA Technology (IDT) für die tAncFMOs bestellt: 1–3, 1–4, 1–5, 5 und 4× , 4×′, 12× bzw. 16× Varianten. Lyophilisierte Gene wurden auf eine Endkonzentration von 10 ng µl−1 in sterilem 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, resuspendiert. Alle tAncFMO-Gene wurden nach der Golden-Gate-Klonierungsmethode kloniert. Der Empfängervektor war ein pBAD-Plasmid, das so modifiziert wurde, dass das Zielprotein an seinem N-Terminus fusioniert mit einem N-6xHis-tag-SUMO-Protein exprimiert wird. Die Klonierungsmischung war die folgende: 55,4 ng tAncFMOs-Insert, 75 ng Golden Gate-Eintrittsvektor (ein Molverhältnis von 2:1 Insert:Vektor), 15 U BsaI-HF V2, 15 U T4-DNA-Ligase, T4-DNA-Ligasepuffer (1×) und nukleasefreies Wasser bis zu einem Endvolumen von 20 μl zugegeben. Eine Negativkontrolle wurde ohne Insert hergestellt und die PCR-Zyklen waren wie folgt: Auf den ersten Schritt mit einem Zyklus bei 37 °C für 1 Stunde folgte ein Zyklus bei 55 °C für 10 Minuten. Anschließend wurde die Temperatur 20 Minuten lang auf 65 °C eingestellt und bei 8 °C gehalten. Nach der Klonierung wurden die pBAD-6xHis-SUMO-tAncFMO-Plasmide in CaCl2-kompetente E. coli NEB10β-Zellen transformiert. 5,0 μl Plasmid-DNA wurden zu 100 μl CaCl2-kompetenten Zellen gegeben und 30 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden die Zellen 30 Sekunden lang einem Hitzeschock bei 42 °C ausgesetzt und 5 Minuten lang auf Eis inkubiert. 500 μl LB-SOC wurden hinzugefügt, damit sich die Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C erholen konnten. Das resuspendierte Zellpellet wurde dann auf LB-Agar mit 100 μg ml-1 Ampicillin ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Plasmide wurden gereinigt und durch Sequenzierung verifiziert. Zwanzigprozentige Glycerinvorräte wurden bei –70 °C gelagert.

Ein Vorinokulum von 4 ml LB-amp (50 μg ml-1) wurde über Nacht bei 37 °C gezüchtet und zum Animpfen von 2-l-Kolben mit Schikanen verwendet, die 400 ml Terrific-Broth-Medium enthielten, ergänzt mit 50 mg l-1 Ampicillin und bei 37 °C inkubiert. Die Expression wurde durch Zugabe von 0,02 % L-Arabinose aus einer sterilen 20 %igen Stammlösung (Gew./Vol.) induziert, wenn die OD600 zwischen 0,2 und 0,5 lag. Die Kulturen wurden vor der Ernte insgesamt 30 Stunden lang bei 24 °C unter Schütteln gezüchtet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (2755 g, 25 Min.) geerntet. Die Pellets wurden in Puffer A (250 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,5) im Verhältnis 5:1 [Volumen (ml): Masse (g)] resuspendiert und mit 0,10 mM Phenylmethylsulfonylfluorid und 1,0 mM β- Mercaptoethanol. Der Zellaufschluss erfolgte durch Ultraschallbehandlung (70 % Amplitude, 5 s EIN, 5 s AUS, insgesamt 20 Minuten). Nach 20-minütiger Zentrifugation bei 19.500 g wurde der Überstand entfernt und das Pellet in Puffer A2 (250 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat, 0,5 % TritonTm X-100 reduziert, pH 7,5) resuspendiert (TritonTm X-100 reduziert, Kat . # X100RS-25G, Sigma-Aldrich) im gleichen Verhältnis wie zuvor (5:1). Das resuspendierte Pellet wurde über Nacht bei 4 °C gemischt, um die Membranproteine ​​zu solubilisieren, und bei 19.500 g zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. tAncFMOs wurden mit einem Metallionen-Affinitätschromatographieharz (Kat. Nr. 17-5318-02, Cytiva) gereinigt. Der zellfreie Extrakt wurde auf die Säule aufgetragen und mit steigenden Konzentrationen an Imidazol gewaschen. Puffer B enthielt (250 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat, 300 mM Imidazol, 0,5 % TritonTM X-100 reduziert, pH 7,5). Nach den Waschschritten mit 0, 25 und 50 mM Imidazol wurde das Protein schließlich mit 300 mM Imidazol eluiert. Der Elutionspuffer wurde mit einem Lagerpuffer (250 mM NaCl, 50 mM Kaliumphosphat, 0,05 % TritonTm .

Gereinigte 6xHis-SUMO-markierte Enzyme wurden mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –70 °C aufbewahrt. Mit diesen Aliquots wurden Experimente durchgeführt. Die Konzentrationen von tAncFMOs wurden aus gefrorenen Proben bestimmt, die bei Raumtemperatur aufgetaut und später bei 95 °C inkubiert, zentrifugiert und der Überstand auf einem Jasco V-660-Spektrophotometer analysiert wurden. Unter Verwendung von εFAD = 11,3 mM−1 cm−1 bei 450 nm wurde die Menge an Holoenzym quantifiziert und für die anderen jeweiligen Aliquots als gleich angesehen.

Für die ortsspezifische Mutagenese wurde eine PCR-Reaktionsmischung mit 10 µM Primer, vorwärts und rückwärts, 100 ng Template-DNA, 1,6 % DMSO, 0,8 mM MgCl2 und 1× Pfu Ultra II Hotstart Master Mix (Kat.-Nr. 600850, Agilent). Der Quick-Change-PCR-Zyklus wurde mit der folgenden Methode durchgeführt: Zuerst eine 5-minütige Inkubation bei 95 °C, dann wurden die Zyklen (95 °C für 5 Minuten, 60 °C für 30 Sekunden, 72 °C für 6 Minuten) 25 Mal wiederholt ; gefolgt von 72 °C für 10 Minuten und abschließend bei 8 °C in der Warteschleife. Die PCR-Mischung wurde über Nacht mit DpnI verdaut und in E. coli-CaCl2-kompetente Zellen transformiert. Nachfolgende Mutationen wurden unter Verwendung der zuvor erhaltenen Mutanten durchgeführt. Die folgenden Primer wurden verwendet: T60I Fw 5′-GCGCGCATCAATCTATAAAAGTGTAATTATAAACACGAGCAAAGAG-3′

& Rv 5′-CTCTTTGCTCGTGTTTATAATTACACTTTTATAGATTGATGCGCGC-3′;

N222S Fw 5′-GGGAAGCTGGGTCCTGAATCGGGTATCG-3′ &

Rv 5′-CGATACCCGATTCAGGACCCAGCTTCCC-3′;

N275H Fw 5′-CTACGGATTAGTGCCTCAACATAGAATCCTTTCCCAACA-3′

& Rv 5′-TGTTGGGAAAGGATTCTATGTTGAGGCACTAATCCGTAG-3′;

N462H Fw 5′-GGTTTGTTACGAGTCAGCGTCATACCATTCAAACGGATTAT-3′ &

Rv 5′-ATAATCCGTTTGAATGGTATGACGCTGACTCGTAACAAACC-3′

Zur Beurteilung der S-Oxidationsaktivität wurden die aromatischen Thioether Methyl-p-tolylsulfid (Kat.-Nr. 275956-5G, Sigma-Aldrich) und das sperrige Benzylphenylsulfid (Kat.-Nr. 8415660025, Sigma-Aldrich) getestet52,53. Für die N-Oxidationsaktivität wurden Benzydamin (Kat.-Nr. B5524-5G, Sigma-Aldrich) und Tamoxifen (Kat.-Nr. T5648-1G, Sigma-Aldrich) ausgewählt54,55. Um die BV-Aktivität zu verfolgen, wurden das aliphatische Hepta-2-on (Kat.-Nr. 537683-100 ML, Sigma-Aldrich), das alicyclische Cyclohexanon (Kat.-Nr. 29140-100 ML, Sigma-Aldrich) und das aromatische Phenylaceton (Kat.-Nr. 135380-100G, Sigma-Aldrich) wurden ausgewählt56,57.

Die Substratumwandlungen wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt, wobei 1,0–5,0 mM Substrat (1 % Methanol), 0,10 mM NADPH, 2,0 µM Enzym, 5,0 µM Phosphitdehydrogenase (PTDH, selbst hergestellt58) und 20 mM Natriumphosphit verwendet wurden. Die letzten beiden Komponenten wurden als Regenerationssystem für NADPH verwendet und die Kontrolle enthielt kein tAncFMO. Alle Verbindungen wurden in Lagerpuffer (50 mM KPi, 250 mM NaCl, 0,05 % TritonTM unter Schütteln, für 16 Stunden. Die Umwandlungen von Phenylaceton, Heptan-2-on, Cyclohexanon, Benzylphenylsulfid und Methyl-p-tolylsulfid wurden mittels GC-MS analysiert, während die Umwandlungen von Benzydamin und Tamoxifen mittels HPLC überwacht wurden. Aufgrund ihrer schlechten Löslichkeit wurden die Umwandlungen von Tamoxifen, Benzydamin und Benzylphenylsulfid mit 1,0 mM Substrat durchgeführt, während die übrigen Substrate bei 5,0 mM getestet wurden.

Für die GC-MS-Analyse wurden die Verbindungen durch Zugabe eines Volumens Ethylacetat mit 0,02 % (v/v) Mesitylen als internem Standard extrahiert. Die Proben wurden 20 s lang gevortext, zentrifugiert und die organische Phase wurde durch wasserfreies Magnesiumsulfat eluiert. GC-MS-Analysen wurden in einem GCMS-QP2010 Ultra-Gerät (SHIMADZU) unter Verwendung einer HP-1- und HP-5-ms-Agilent-Säule (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm) durchgeführt. Die Methode war die folgende: Injektor- und Detektortemperatur bei 250 °C, ein Split-Verhältnis von 5,0 und ein Injektionsvolumen von 1 μl. Die Säulentemperatur wurde 4 Minuten lang bei 50 °C gehalten, um 10 °C/Minute auf 250 °C erhöht und 5 Minuten lang gehalten. Die Retentionszeiten der Substrate und Produkte werden in den Zusatzinformationen (Tabelle S3) mit den entsprechenden Massenspektren angezeigt. Die Umrechnungen wurden basierend auf der Substratverarmung berechnet und mit dem internen Standard normalisiert.

HPLC-Analysen wurden durchgeführt, nachdem 300 μl der Probe in 1200 μl Acetonitril verdünnt, 20 s lang gevortext und zentrifugiert wurden. Die Analyse des Überstands wurde mittels Umkehrphasen-HPLC durchgeführt. Proben wurden mit einem Volumen von 10 μl auf ein JASCO AS2051 Plus HPLC-System injiziert, das mit einer Grace Alltima HP C18-Säule (5 μm, 4,6 × 250 mm) ausgestattet war. Die verwendeten Lösungsmittel waren Wasser mit 0,1 % v/v Ameisensäure (A) und Acetonitril (B) und die Durchflussrate betrug 0,8 ml.min-1. Für Benzydamin entsprach die Methode 8 Minuten bei einem isokratischen Fluss von 35 % B und 65 % A. Benzydamin und Benzydamin-N-oxid wurden bei 308 nm mit einer Retentionszeit von 5,3 Minuten bzw. 5,7 Minuten nachgewiesen. Für Tamoxifen war die Methode die folgende: 30 Minuten auf einem Gradienten von 40–95 % B, 3 Minuten mit 95 % B, gefolgt von einem 5-minütigen verringerten Gradienten von 95–40 % B und schließlich einer erneuten Gleichgewichtseinstellung für 2 Minuten. Tamoxifen und Tamoxifen-N-oxid wurden bei 276 nm mit einer Retentionszeit von 10,5 min bzw. 11,7 min nachgewiesen. Die Identität beider Produkte wurde anhand der entsprechenden Standards bestätigt und der Umsatz basierend auf der Substratverarmung berechnet.

Um die Bildung von C4a-(Hydro)peroxyflavin zu beobachten, führten wir Stopped-Flow-Experimente mit dem Stopped-Flow-Spektrometer SX20 durch, das entweder mit dem Photodiodenarray-Detektor oder dem Photomultiplier Tubes (PMT)-Modul ausgestattet war (Applied Photophysics, Surrey, UK). . Die Ergebnisse wurden durch Mischen von 50 μl zweier Lösungen im Einzelmischmodus erzielt. Alle Lösungen wurden in 50 mM Kaliumphosphat, 250 mM NaCl und 0,05 % TritonTM X-100 reduziert, pH 7,5, bei 25 °C hergestellt. Für jede Reaktion wurde eine Konzentration von 8–15 μM Enzym verwendet und die Messungen wurden in technischen Dreifachversuchen durchgeführt. Bei Bedarf wurden die Lösungen mit 5,0 mM Glucose ergänzt. Enzymlösungen wurden durch 10-minütiges Spülen mit Stickstoff anaerob gemacht, gefolgt von der Zugabe von 0,3 μM Glucoseoxidase (Aspergillus niger, Typ VII, Kat.-Nr. G2133-50KU, Sigma-Aldrich), um den restlichen Sauerstoff zu verbrauchen. Um den Flavin-Cofaktor in den tAncFMOs zu reduzieren, wurden der Enzymlösung 1–1,2 Äquivalente NADPH zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde auf Eis inkubiert, bis das Bleichen des FAD vollständig war, was eine vollständige Reduktion zu FADH2 anzeigte. Um die Geschwindigkeit der Zwischenproduktbildung zu bestimmen, wurden die reduzierten Enzyme mit Puffern gemischt, die unterschiedliche Disauerstoffkonzentrationen enthielten. Die endgültigen Disauerstoffkonzentrationen (0,13, 0,31, 0,61, 0,96 mM nach dem Mischen) wurden durch Mischen der anaeroben Enzymlösung mit (1) luftgesättigtem Puffer; (2) gleiche Volumina von 100 % Argon-Puffer und 100 % O2-Puffer; (3) 100 % O2-Puffer; (4) 100 % O2-Puffer auf Eis. Alle Lösungen wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur durchperlen gelassen, mit Ausnahme der letzten Lösung, die auf Eis durchgeführt wurde. Beobachtete Raten (kobs) wurden durch Anpassen von Spuren an Exponentialfunktionen bestimmt. Alle Daten wurden mit der Software Pro-Data Viewer v4.2.12, Pro-Kineticist v1.0.13 (Applied Photophysics, Surrey, UK) und GraphPad Prism 6.05 (La Jolla, CA, USA) analysiert.

Steady-State-Kinetiktests wurden in technischen Dreifachansätzen auf einem Jasco V-660-Spektrophotometer durchgeführt. Die Enzymaktivität der Vorfahrenproteine ​​wurde durch Überwachung des NADPH-Verbrauchs gemessen (Absorption bei 340 nm, ε340 = 6,22 mM−1 cm−1 für NADPH). Der für kinetische Analysen verwendete Puffer war 50 mM Kaliumphosphat, 250 mM NaCl, 0,05 % TritonTM X-100 reduziert, pH 7,5. Das Spektrophotometer wurde auf 25 °C eingestellt und die Reaktion durch Zugabe des Enzyms gestartet. Für die KM-Bestimmung der Substrate wurden 100 μM NAD(P)H verwendet. Die NAD(P)H-Entkopplungsraten wurden in Abwesenheit von Substraten in Duplikaten bestimmt.

Die Sauerstoffaffinität wurde mit dem Sauerstoffelektrodensystem The Oxygraph+ (Hansatech Instruments Ltd., UK) bestimmt. Der Sauerstoffverbrauch wurde überwacht, nachdem Enzyme (Konzentration im Bereich von 3–12 μM) mit luftgesättigtem Puffer, der den NADPH-Cofaktor und ein Substrat enthielt, gemischt wurden. Alle Messungen wurden in Duplikaten durchgeführt. Bei Raumtemperatur enthält luftgesättigtes Wasser etwa 0,2 mM Sauerstoff. Daher wurde der Reaktionsmischung ein Überschuss an NADPH-Cofaktor (0,6 mM) und Substrat (Methyl-p-tolylsulfid oder Phenylaceton, 2,5 mM) zugesetzt, um sicherzustellen, dass die Sauerstoffkonzentration der einzige Faktor ist, der die Kobs-Werte beeinflusst. Als der Sauerstoff vollständig aufgebraucht war, war die Messung beendet. Die Kobs-Werte wurden mit der OxyTrace+ Windows®-Software (Hansatech Instruments Ltd., UK) berechnet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Ahnensequenzen (tAncFMOs) wurden in der Genbank-Datenbank unter den Zugangscodes OP381052 (tAncFMO1–5), OP381053 (tAncFMO5), OP381054 (tAncFMO1–4) und OP381055 (tAncFMO1–3) hinterlegt. Die in dieser Studie generierten experimentellen Daten sind in der Datei „Ergänzende Informationen/Quelldaten“ enthalten. Der gesammelte Datensatz für die phylogenetische Analyse ist in den Zusatzinformationen enthalten. Die in dieser Studie verwendeten taxonomischen Beziehungen und evolutionären Zeitskalendaten sind in der TimeTree 5-Wissensdatenbank [http://www.timetree.org/] verfügbar. Die in dieser Studie verwendeten Silhouettenbilder von Organismen sind in der PhyloPic-Datenbank [http://www.phylopic.org/] verfügbar. Die in dieser Studie verwendeten Strukturdaten sind in der PDB-Datenbank unter den Zugangscodes 6SEK (mAncFMO5) und 6SF0 (mAncFMO2) verfügbar. Die in dieser Studie verwendeten Sequenzdaten sind in der Genbank-Datenbank unter den Zugangscodes OP381050 (mAncFMO1), OP381047 (mAncFMO2), OP381048 (mAncFMO3–6) und OP381049 (mAncFMO5) verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Wir danken Dr. Hein Wijma für die Bereitstellung der AlphaFold-Modelle und die Durchführung der Docking-Experimente. Wir danken Dr. Walter Lapadula für die Diskussionen zur Evolutionsgeschichte von FMOs. Diese Arbeit wurde finanziert durch: das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 847675, das COFUND-Projekt oLife (MLM), das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skłodowska-Curie-Finanzhilfevereinbarung Nr. 722390 (GB) und Fondazione Cariplo Nr. 2020-0894 (AM und MWF).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Gautier Bailleul, Guang Yang.

Gruppe Molekulare Enzymologie, Universität Groningen, Groningen, Niederlande

Gautier Bailleul, Guang Yang, Marco W. Fraaije und Maria Laura Mascotti

Abteilung für Biologie und Biotechnologie „Lazzaro Spallanzani“, Universität Pavia, Pavia, Italien

Callum R. Nicoll & Andrea Mattevi

IMIBIO-SL CONICET, Fakultät für Biochemische Chemie und Pharmazie, Nationale Universität San Luis, San Luis, Argentinien

Maria Laura Mascotti

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Alle aufgeführten Autoren führten Experimente durch und/oder analysierten Daten. GB und CRN erstellten die Reinigungs- und Expressionsprotokolle, führten die Evolutionsanalyse und die Rekonstruktion der Ahnensequenz unter MLM-Anleitung durch. GB führte alle Klon-, Mutagenese- und Konversionsexperimente durch. GB und GY produzierten die Enzyme und führten die Steady-State-Kinetik durch. GY führte die Stopped-Flow- und Sauerstoffaffinitätsexperimente durch. CRN erstellte die Strukturmodelle und führte die strukturmechanistische Analyse durch. GY, GB, CRN und MLM haben die Zahlen erstellt. MLM hat den Artikel geschrieben und CRN, AM und MWF haben ihn bearbeitet. Alle Autoren gaben kritisches Feedback und halfen bei der Gestaltung der Forschung, Analyse und Arbeit. MLM entwickelte die ursprüngliche Idee mit Unterstützung von AM und MWF.

Korrespondenz mit Maria Laura Mascotti.

Alle Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bailleul, G., Yang, G., Nicoll, CR et al. Entwicklung der Enzymfunktionalität in den Flavin-haltigen Monooxygenasen. Nat Commun 14, 1042 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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Eingegangen: 14. September 2022

Angenommen: 15. Februar 2023

Veröffentlicht: 24. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36756-x

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