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May 06, 2023

Antivirale Signalübertragung durch eine zyklische Nukleotid-aktivierte CRISPR-Protease

Naturband 614, Seiten

Nature Band 614, Seiten 168–174 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

CRISPR-Abwehrsysteme wie das bekannte DNA-Targeting-System Cas9 und das RNA-Targeting-Typ-III-System sind in Prokaryoten weit verbreitet1,2. Letzteres orchestriert eine komplexe antivirale Reaktion, die durch die Synthese zyklischer Oligoadenylate nach Erkennung fremder RNA initiiert wird3,4,5. Unter der großen Menge an Proteinen, die mit Typ-III-Systemen verbunden sind und voraussichtlich zyklische Oligoadenylate6,7 binden, stach uns eine CRISPR-assoziierte Lon-Protease (CalpL) heraus. CalpL enthält eine Sensordomäne der SAVED-Familie7, fusioniert mit einer Lon-Protease-Effektordomäne. Die Wirkungsweise dieses Effektors ist jedoch unbekannt. Hier berichten wir über die Struktur und Funktion von CalpL und zeigen, dass dieses lösliche Protein einen stabilen dreiteiligen Komplex mit zwei anderen Proteinen, CalpT und CalpS, bildet, die auf demselben Operon kodiert sind. Nach der Aktivierung durch zyklisches Tetraadenylat (cA4) oligomerisiert CalpL und spaltet spezifisch das MazF-Homolog CalpT, wodurch der extrazytoplasmatische σ-Faktor CalpS aus dem Komplex freigesetzt wird. Unsere Daten stellen einen direkten Zusammenhang zwischen der CRISPR-basierten Detektion fremder Nukleinsäuren und der Transkriptionsregulation her. Darüber hinaus zeigt das Vorhandensein einer SAVED-Domäne, die zyklisches Tetraadenylat in einem CRISPR-Effektor bindet, eine Verbindung zum auf zyklischen Oligonukleotiden basierenden Antiphagen-Signalsystem.

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Die Kristallstrukturen wurden mit den Zugangscodes 7QDA, 8B0R und 8B0U in der Protein Data Bank-Datenbank hinterlegt. Die SAXS-Daten und -Modelle wurden in der Small Angle Scattering Biological Data Bank mit den Zugangscodes SASDQM4, SASDQN4, SASDQP4 und SASDQQ4 hinterlegt. Die folgenden Proteindatenbankeinträge wurden in dieser Studie verwendet: 2H27, 3K1J, 4ME7, 4IZJ, 4LUP, 5ZX2, 5CR2, 6VM6, 6SCE und 7RWK. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Die Synchrotron-MX-Daten wurden an der Strahllinie P13 gesammelt, die von Mitarbeitern des EMBL Hamburg am Speicherring PETRA III (DESY, Hamburg, Deutschland) betrieben wird. Wir danken G. Bourenkov und I. Bento für die Unterstützung bei der Nutzung der Strahllinie; V. Siksnys für hilfreiche Diskussionen; S. Shirran und S. Synowsky für die MS-Analyse; N. Brenner für technische Unterstützung; und M. Drag und J. Grzymska für Diskussionen und ein erstes Peptidscreening. MG und JLS-B. werden von der Deutschen Forschungsgemeinschaft im Rahmen der Deutschen Exzellenzstrategie –EXC2151–390873048 – gefördert. MFW dankt einem European Research Council Advanced Grant (Grant-Nummer 101018608) und dem China Scholarship Council (Referenz 202008420207 an HC). BEB dankt BBSRC für die Finanzierung von EPR-Ausrüstung (BB/R013780/1 und BB/T017740/1). GH dankt der Deutschen Forschungsgemeinschaft für die Förderung (Fördernummer HA6805/6-1).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Christophe Rouillon, Niels Schneberger

Institut für Strukturbiologie, Universität Bonn, Bonn, Deutschland

Christophe Rouillon, Niels Schneberger, Jonas Moecking, Martin F. Peter, Matthias Geyer & Gregor Hagelueken

Max-Planck-Institut für Neurobiologie des Verhaltens – Caesar, Bonn, Deutschland

Christophe Rouillon, Wolfgang Boenigk und Reinhard Seifert

Fakultät für Biologie, University of St Andrews, St Andrews, Großbritannien

Haotian Chi & Malcolm F. White

Institut für Klinische Chemie und Klinische Pharmakologie, Universität Bonn und Universitätsklinikum Bonn, Bonn, Deutschland

Katja Blumenstock & Jonathan L. Schmid-Burgk

Europäisches Labor für Molekularbiologie (EMBL), Standort Hamburg, Hamburg, Deutschland

Stefano Da Vela & Dmitri Svergun

EaStCHEM School of Chemistry, Forschungskomplex für biomedizinische Wissenschaften und Zentrum für Magnetresonanz, University of St Andrews, North Haugh, St Andrews, Großbritannien

Katrin Ackermann & Bela E. Bode

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CR und GH konzipierten und überwachten die Studie und führten erste Proteinexpressions- und Kristallisationsexperimente mit CalpL durch. RS und WB haben das ursprüngliche CalpL-Konstrukt geklont. Von NS, CR, MFW und GH entworfene Experimente. NS optimierte die Reinigung von CalpL und CalpT, kristallisierte CalpL, CalpL-cA4 und CalpL-CalpT10 und etablierte und führte die Spaltungstests, SEC-MALS- und DLS-Experimente durch. NS und MFP klonierten alle mutierten Konstrukte. GH und NS lösten und verfeinerten die Strukturen CalpL, CalpL–cA4 und CalpL–CalpT10. JM und MG haben die SPR-Experimente entworfen und durchgeführt. HC und MFW planten und führten die Ribonukleasetests durch. HC, NS und MFW klonierten und reinigten CalpS und führten die Bindungs- und Koexpressionsexperimente mit CalpS durch. SDV führte die SAXS-Experimente durch. SDV und DS führten eine SAXS-Datenanalyse und -interpretation durch und verfassten die entsprechenden Abschnitte. BEB und KA führten die gepulsten EPR-Experimente durch, analysierten die Daten, bereiteten Zahlen vor und verfassten die entsprechenden Abschnitte. KB und JLS-B. entwarf und führte die RNase-Sequenzierungstests durch. CR, MFW, HC, NS und GH analysierten die Daten und verfassten die Arbeit. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und kommentierten das Manuskript in allen Phasen.

Korrespondenz mit Christophe Rouillon oder Gregor Hagelueken.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature dankt Simon Jackson, David Taylor und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Gelfiltrationschromatographie (Superdex 200 16/60) von CalpL. Einschub: SDS-PAGE-Analyse der durch den blauen Balken im Chromatogramm angezeigten Fraktionen. Das Experiment wurde mehrmals durchgeführt (n > 3 biologische Replikate). b, TM-Vorhersage durch den TMHMM 2.0-Server28 im Vergleich zur experimentellen Struktur. c, Repräsentative Elektronendichte der SeMet CalpL-Kristallstruktur. Das Strukturmodell ist in Kugel-Stab-Darstellung gezeichnet. Ausgewählte Reste werden markiert. Das schwarze Netz ist eine 2mFo-DFc-Elektronendichtekarte mit einer Kontur von 1,0 σ. d, Topologiediagramm von CalpL. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Quelldaten

a, CalpL ist als farbcodiertes Cartoon-Modell wie in Abb. 1 dargestellt. Die Lon-Protease aus T. onnorineus (PDB-ID: 3K1J, DALI Z-Score: 12,8)76 ist als weißes Cartoon-Modell dargestellt. b, Tabelle mit Proteinen mit ähnlichen Domänenstrukturen17,23,27,29,30,76,77,78. c, Oberflächenelektrostatik der Region des aktiven Zentrums der Lon-Protease. Die katalytische Dyade ist markiert. Die graue Linie markiert die wahrscheinliche Substratbindungsstelle. d, Überlagerung des aktiven Zentrums von CalpL mit dem Acyl-Enzym-Zwischenprodukt der Gelbflossen-Asciitis-Virus-Protease. CalpL ist in Stäbchendarstellung und farbcodiert wie in Abb. 1. Kette D der Struktur 4IZJ27 (Reste 630–640) wurde den entsprechenden Resten von CalpL (150–160) überlagert, was zu einem rmsd von 0,314 Å führte. Von 4IZJ wird nur das Acyl-Enzym-Zwischenprodukt im Sticks-Modus angezeigt. Ausgewählte Reste und die Positionen der P1-P3-Stellen sind angegeben. e, Überlagerung von CalpL (Farbschema wie in Abb. 1) mit dem Cap4-Protein (weiß, PDB-ID: 6VM6)23. f, Überlagerung der CalpL SAVED-Domäne (Farbschema wie in Abb. 1) mit dem Can1-Protein (weiß, PDB-ID: 6SCE)17. g, Überlagerung der CalpL SAVED-Domäne (Farbschema wie in Abb. 1) mit den CARF-Domänen des Cap5-Proteins (weiß, PDB-ID: 7RWK)29.

a, Nahaufnahme von cA4 (grün), gebunden an die SAVED-Domäne von CalpL. Das blaue Netz ist eine 2mFo-DFc-Elektronendichtekarte mit einer Kontur von 1,0 σ. b, Überlagerung von CalpL-Apo (weiß) auf der cA4-Komplexstruktur (farbcodiert wie in Abb. 1). c, Strukturelle Ausrichtung der SAVED-Domänen von CALP/cA4 und Cap4/cA3 (weiß).

a, b, Eine Überlagerung der vorhergesagten CalpT-Struktur (vergleiche Abb. 2B) mit einem Monomer des MazF/ssRNA-Komplexes (lila/orange) (PDB-IDs: 5CR2)79. Die AlphaFold233-Vorhersagekonfidenz wird auf die CalpT-Struktur abgebildet (pLDDT48, vorhergesagter lokaler Distanzdifferenztest). b, Eine Überlagerung der vorhergesagten CalpT-Struktur (vergleiche Abb. 2b) mit einem Monomer des MazE/F-Komplexes (PDB-IDs: 4ME7)35. Die AlphaFold233-Vorhersagekonfidenz wird auf die CalpT-Struktur abgebildet (pLDDT48, vorhergesagter lokaler Distanzdifferenztest). c, Gelfiltrationschromatographie (Superdex 75 16/60) von CalpT. Das Experiment wurde mehrmals durchgeführt (n > 3 biologische Replikate). Gemäß den MALS-Daten in Abb. 3 verhält sich isoliertes CalpT wie ein Monomer. Einschub: SDS-PAGE-Analyse der durch den blauen Balken angezeigten Fraktionen. d, Peptid-Fingerabdrücke von Spaltungsbändern. Die angegebenen Gelbänder wurden aus dem Gel ausgeschnitten und zur Identifizierung an die Massenspektrometrie- und Proteomics-Einrichtung der University of St Andrews (Fife, UK, https://mass-spec.wp.st-andrews.ac.uk) geschickt. . Rote Buchstaben kennzeichnen Peptide, die in der jeweiligen Probe identifiziert wurden. Der Versuch wurde einmal durchgeführt. e, Mutationsanalyse potenzieller CalpL-Spaltungsstellen in CalpT. Das Experiment wurde mehrfach durchgeführt (n > 3 technische Wiederholungen). Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Quelldaten

a, Single-Cycle-Kinetik-SPR-Daten der CalpL/T-Wechselwirkung. Die Wechselwirkung ist sehr stark, kann jedoch mit einem 1:1-Bindungsmodell nicht zufriedenstellend angepasst werden. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt (n = 2 technische Wiederholungen). b, Wie a), jedoch wurde in diesem Experiment ein künstliches Konstrukt eines unspezifischen VHH, fusioniert mit CalpT, als Analyt verwendet. Die Interaktion ist der CalpL/T-Interaktion sehr ähnlich. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt (n = 2 technische Wiederholungen). c, Schematische Darstellung zweier künstlicher Konstrukte, die die CalpL-Spaltungsstelle enthalten. d, CalpL spaltet ein künstliches Konstrukt eines unspezifischen VHH, das an CalpT10 fusioniert ist, aber kein Konstrukt aus zwei VHHs, die durch die CalpL-Spaltungsstelle fusioniert sind. Der Versuch wurde einmal durchgeführt. e, SEC-MALS-Spuren (durchgezogene Linien: UV280, gestrichelte Linien: MWMALS) von Proteolysereaktionen mit verschiedenen Kombinationen von CalpL S152A, CalpT und cA4. Das Schema zeigt die Molekülspezies hinter den einzelnen Peaks. Die Experimente wurden zweimal mit leicht unterschiedlichen Pufferbedingungen durchgeführt (n = 2 technische Wiederholungen). f, Bindung von CalpL wt an die angegebenen CalpT-Mutanten in Abwesenheit von cA4. Das Schema zeigt die Position der Mutante im CalpL/T-Komplex. Die Experimente wurden einmal durchgeführt. g, Repräsentative Elektronendichte der CalpL/T10-Kristallstruktur. Ausgewählte Reste werden markiert. Das schwarze Netz ist eine 2mFo-DFc-Elektronendichtekarte mit einer Kontur von 1,0 σ. h, SEC-SAXS-Experiment des CalpL/T10-Komplexes. Der Versuch wurde einmal durchgeführt. Es wurden 30 Probenintensitätsrahmen und 60 Pufferintensitätsrahmen gesammelt und gemittelt. Für jeden Datensatz und Winkelpunkt wurden die Fehler gemäß der Poisson-Statistik berechnet. Die Datenpunkte stellen die durchschnittliche Intensitätsdifferenz (Probenpuffer) dar und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Quelldaten

a, Dynamische Lichtstreuexperimente (sechs Zeitreihen, jede Reihe durch einen gestrichelten Kreis markiert, einzelne Datenpunkte werden angezeigt) bei unterschiedlichen Proteinkonzentrationen und in Abwesenheit (t = 0: hellgrau bis t = 60 min: dunkelgrau) und Anwesenheit (t = 0: Cyan bis t = 60 min: Violett) von cA4 zeigen eine cA4-abhängige Oligomerisierung von CalpL. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt (n = 2 technische Wiederholungen), b, SAXS-Experimente bei unterschiedlichen Konzentrationen. Die Experimente wurden einmal durchgeführt. Für jedes Experiment wurden dreißig Probenintensitätsrahmen und sechzig Pufferintensitätsrahmen gesammelt und gemittelt. Für jeden Datensatz und Winkelpunkt wurden die Fehler gemäß der Poisson-Statistik berechnet. Die Datenpunkte stellen die durchschnittliche Intensitätsdifferenz (Probenpuffer) dar und die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar. c, Ab-initio/Starrkörpermodell eines CalpL-Dimers, erstellt mit DAMMIF und SASREFMX durch eine globale Anpassung einer Monomer-Dimer-Mischung an die verschiedenen Konzentrationen (rote Linien). Die Kristallstruktur des CalpL-Monomers ist im gleichen Maßstab dargestellt.

Quelldaten

a, Fluoreszenzbild der denaturierenden PAGE zur Bestimmung der Ribonukleaseaktivität der Reaktionen in b) gegenüber sechs fluoreszenzmarkierten RNA-Substraten (aufgelistet in c)). Nach 30-minütiger Inkubation mit RNAs bei 60 °C wurde keine Spaltung beobachtet. Das Experiment wurde dreimal durchgeführt (n = 3 biologische Replikate) b, SDS-PAGE-Analyse der cA4-induzierten Spaltung von CalpT (33 kDa) durch CalpL. Die Spaltung ist nach 60 Minuten bei 60 °C abgeschlossen. Das Experiment wurde dreimal durchgeführt (n = 3 biologische Replikate) c, Sequenzen der RNA-Substrate d, links: MazF wurde mit einer einzelsträngigen RNA-Bibliothek inkubiert, die 10 zufällige Basen enthielt. Mithilfe der Illumina-Sequenzierung wurde nach Sequenzen gesucht, die von MazF gespalten wurden. Im Vergleich zu einer Kontrollreaktion ohne MazF waren Sequenzen, die die bekannte MazF-Zielstelle (ACA) enthielten, abgereichert. rechts: gleiches Experiment, jedoch mit CalpL/T ± cA4 anstelle von MazF. Es wurden keine Sequenzen außerhalb der Diagonale und daher keine ssRNase-Aktivität beobachtet. Das Experiment wurde zweimal durchgeführt (n = 2 biologische Replikate). e, Oligonukleotide für die Experimente in d) f, AlphaFold2-Dimer-Modelle von CalpT23. g, Bestes Modell (pLDDT48, vorhergesagter lokaler Distanzdifferenztest) einschließlich MTSSL-Spinlabel80. h, X-Band cw-EPR-Spektrum von CalpL/T E119R1. Die Menge an freiem Etikett (scharfe Spitzen) beträgt ~10 %. Die Markierungseffizienz wurde mit ~100 % ermittelt. i, PELDOR-Zeitspuren von CalpL/T E119R1 in Anwesenheit (rot) und Abwesenheit (schwarz) von cA4. j, Konsensverteilungen und entsprechende Unsicherheitsbänder. Farbige Balken zeigen Zuverlässigkeitsbereiche an (grün: Form zuverlässig; gelb: Mittelwert und Breite zuverlässig; orange: Mittelwert zuverlässig; rot: keine Quantifizierung möglich). Mit mtsslWizard80 berechnete vorhergesagte Entfernung. Das EPR-Experiment wurde zweimal durchgeführt (n = 2 technische Wiederholungen). Daten zur Gelquelle finden Sie in der ergänzenden Abbildung 1.

Quelldaten

a, Vorhersage von CalpS allein. Das Protein wird als Cartoon dargestellt und entsprechend der Vorhersagekonfidenz (pLDDT48, vorhergesagter lokaler Distanzdifferenztest) eingefärbt. b, Vorhersage des CalpT/S-Komplexes. c, Überlagerung von CalpS mit 4LUP81 und 2H2782 identifiziert die DNA-Bindungsregionen von CalpS. d, Modell von CalpS im Kontext eines RNAP/ECF-σ-Faktor/Promotor-Komplexes (PDB: 5ZX283, grau, gelb, grün) aus M. tuberculosis. Beachten Sie, dass die Linkerregion zwischen den σ2- und σ4-Untereinheiten von CalpS geschnitten wurde, um die Überlagerung der σ2- und σ4-Domänen mit denen von 5ZX2 zu ermöglichen. Der Linker ist lang genug, um auf ähnliche Weise wie der σ-Faktor in der 5ZX2-Struktur (gelb) an das RNAP zu binden.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Rouillon, C., Schneberger, N., Chi, H. et al. Antivirale Signalübertragung durch eine zyklische Nukleotid-aktivierte CRISPR-Protease. Natur 614, 168–174 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

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Eingegangen: 06. Dezember 2021

Angenommen: 17. November 2022

Veröffentlicht: 24. November 2022

Ausgabedatum: 02. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05571-7

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