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May 31, 2023

Analyse der Auswirkungen der DGAT1-Varianten p.M435L und p.K232A auf prä

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8999 (2023) Diesen Artikel zitieren

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DGAT1 spielt eine wichtige Rolle im Fettstoffwechsel und der Triacylglyceridsynthese. Bisher wurden nur zwei DGAT1-Funktionsverlustvarianten gemeldet, die die Milchproduktionsmerkmale bei Rindern verändern, nämlich p.M435L und p.K232A. Die p.M435L-Variante ist eine seltene Veränderung und wurde mit dem Überspringen von Exon 16 in Verbindung gebracht, was zu einem nicht funktionsfähigen verkürzten Protein führt, und der p.K232A-haltige Haplotyp wurde mit Veränderungen der Spleißrate mehrerer DGAT1-Introns in Verbindung gebracht. Insbesondere wurde die direkte Kausalität der p.K232A-Variante bei der Verringerung der Spleißrate der Intron-7-Verbindung mithilfe eines Minigen-Assays in MAC-T-Zellen validiert. Da gezeigt wurde, dass beide DGAT1-Varianten spleißogen sind, haben wir einen Volllängen-Gentest (FLGA) entwickelt, um p.M435L- und p.K232A-Varianten in HEK293T- und MAC-T-Zellen erneut zu analysieren. Eine qualitative RT-PCR-Analyse von Zellen, die mit dem DGAT1-Expressionskonstrukt voller Länge, das die p.M435L-Variante trägt, transfiziert wurden, zeigte das vollständige Überspringen von Exon 16. Die gleiche Analyse, die mit dem Konstrukt durchgeführt wurde, das die p.K232A-Variante trug, zeigte moderate Unterschiede im Vergleich zum Wild- Typ-Konstrukt, was auf einen möglichen Effekt dieser Variante auf das Spleißen von Intron 7 schließen lässt. Schließlich zeigten quantitative RT-PCR-Analysen von Zellen, die mit dem p.K232A-tragenden Konstrukt transfiziert wurden, keine signifikante Veränderung der Spleißrate der Introns 1, 2 und 7. Zusammenfassend bestätigte die DGAT1 FLGA den zuvor in vivo beobachteten Einfluss von p.M435L, entkräftete jedoch die Hypothese, dass die p.K232A-Variante die Spleißrate von Intron 7 stark verringerte.

Die vom DGAT1-Gen kodierte Diaglycerid-O-Acyltransferase 1 ist das Enzym, das die Synthese von Triglyceriden aus Diglyceriden und Acyl-Coenzym A katalysiert. Im Jahr 2002 wurde die Missense-Variante DGAT1 p.K232A (BTA14:611019AA>GC) mit größeren Variationen von in Verbindung gebracht Milchleistung und Zusammensetzung bei Rindern1. Die Häufigkeit dieser Variante hängt von der jeweiligen Rasse ab, kommt aber häufig bei den Hauptrassen der Milchkühe vor. Aufgrund ihrer wichtigen wirtschaftlichen Auswirkungen auf die Milchindustrie wurde die Rolle der Rindervariante DGAT1 p.K232A eingehend untersucht und überprüft2. Global gesehen war die p.K232A-Variante mit einem geringeren Fettertrag, Fettgehalt und Proteingehalt sowie einer höheren Milchproduktionsprotein- und Laktoseausbeute verbunden. Aus funktioneller Sicht wurde gezeigt, dass diese Variante die DGAT1-Enzymaktivität deutlich verringert, was mit der Verringerung des Milchfettanteils übereinstimmt, der bei heterozygoten und homozygoten p.K232A-Trägern gemessen wurde3. Darüber hinaus wurde auch die Verwendung einer kryptischen 5'-Spleißstelle (5'SS) innerhalb des Exon 8 festgestellt, insbesondere bei Tieren, die das p.K232-Allel tragen. Dieser spezifische Mechanismus wurde jedoch nicht als Hauptelement identifiziert, das Veränderungen in den Milchphänotypen erklären könnte, da der Unterschied im Hinblick auf das abnormale/normale Transkriptverhältnis zwischen homozygoten für das p.K232-Allel, homozygoten für das p.A232-Allel und heterozygoten Tieren bestand schwach3.

Erst kürzlich haben Fink et al. untersuchten die Spleißogenität der p.K232A-Variante eingehender mit einem Ansatz, der auf komplementären In-vivo- und In-vitro-Methoden beruhte4. Nach der Durchführung einer Assoziationsanalyse unter Verwendung eines Brust-RNA-seq-Datensatzes, der 375 laktierende Kühe und 3128 zuvor unterstellte Sequenzvarianten darstellt, die in einem 1-Mbp-Intervall liegen und das DGAT1-Gen überlappen, stellten sie fest, dass der p.K232A-haltige Haplotyp in vivo mit einer verringerten DGAT1-Expression assoziiert war und Modifikationen der Spleißrate mehrerer Introns. Interessanterweise war die p.K232A-Variante der am häufigsten assoziierte SNP hinsichtlich der Modifikation des Spleißens der Introns 2 und 7. Außerdem ergab ein Minigen-Assay in bovinen Brustepithelzellen (MAC-T), dass diese Variante die Spleißrate von Intron 7 verringerte, was bedeutet, dass p.K232A die in vivo beobachtete Spleißmodifikation von Intron 7 verursacht.

Von Fink et al. In einer Studie schien die Veränderung der Spleißrate von Intron 7 auf der Grundlage von In-vivo- und In-vitro-Beweisen der überzeugendste Spleißeffekt zu sein, der direkt der p.K232A-Variante zugeschrieben wird. Darüber hinaus wiesen die Autoren auf einen möglichen Effekt dieser Variante auf die Modifikation der Spleißrate von Intron 2 hin, da sie in vivo stark mit letzterem assoziiert war, konnten diese Hypothese jedoch nicht validieren, da dem von ihnen entwickelten Minigenkonstrukt DGAT1 fehlte Introns 1 und 2. Sie kamen zu dem Schluss, dass die Veränderung der DGAT1-Transkriptexpression zu den phänotypischen Effekten beitragen könnte, die mit der p.K232A-Variante verbunden sind.

Die p.M435L-Variante ist eine seltene Veränderung, die von Lehnert et al. entdeckt wurde. Vor einigen Jahren wurden die Laktationsaufzeichnungen von 2,5 Millionen Kühen untersucht, um signifikante Abweichungen von den Mittelwerten des Milchprotein- und Fettgehalts festzustellen5. Sie filterten 29 Tiere mit abnormalen Milchparametern heraus, darunter eine Kuh mit sehr niedrigem Fettgehalt, und identifizierten anschließend die oben genannte Variante durch genetische Kartierung und Sequenzanalyse. Die detaillierte Zusammensetzung der Milchproben von Kühen, die diese Variante tragen, zeigte auch eine wesentliche Verbesserung des Verhältnisses von gesättigtem/ungesättigtem Milchfett. In einem zweiten Mal führten die Autoren eine qualitative und quantitative RT-PCR unter Verwendung von Gesamt-RNA durch, die einerseits aus der Leber von Wildtyp-Rindern (WT) extrahiert wurde, oder alternativ von Tieren, die die p.M435L-Variante im heterozygoten oder homozygoten Zustand trugen andere Hand. Diese RT-PCR-Analysen zeigten, dass diese Variante zu einem nahezu vollständigen Überspringen des DGAT1-Exons 16 führte. Das resultierende Protein wurde in Saccharomyces cerevisiae exprimiert und war nicht in der Lage, Ölsäure von Coenzym A auf Diacylglycerin zu übertragen. Im Gegensatz dazu ist das unter denselben Bedingungen exprimierte WT-Protein in der Lage, diesen Reaktionsschritt zu katalysieren, der zum Erhalt eines normalen Enzymprodukts erforderlich ist. Diese letzte Beobachtung stützte die ursächliche Rolle von p.M435L bei der Entstehung des in dieser Studie berichteten abnormalen Milchphänotyps.

Full-length gene assays (FLGA) have been routinely used to analyse numerous splicing variants within the human SPINK1 geneA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="#ref-CR6" id="ref-link-section-d226774577e452">6,7,8,9,10 and 5’SS GT>GC or GC>GT variants in 43 different genesGT and GT>GC variants differ markedly in terms of their functionality and pathogenicity. Hum. Mutat. 41, 1358–1364 (2020)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR11" id="ref-link-section-d226774577e459">11,GC variants capable of generating wild-type transcripts. Hum. Mutat. 40, 1856–1873 (2019)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR12" id="ref-link-section-d226774577e462"> 12. Um die Spleißogenität einer Variante zu beurteilen, ist der Minigen-Assay einfacher anzuwenden als der FLGA und wird daher häufiger verwendet. Das FLGA bietet jedoch zwei große Vorteile. Erstens ist die Analyse einer Spleißvariante, die von einem Prä-mRNA-Transkript getragen wird, das von einem episomalen Expressionsvektor erzeugt wurde, biologisch relevanter, wenn die gesamte Gensequenz integriert wird, da bekannt ist, dass die Art und Länge des Sequenzkontexts die RNA beeinflusst Strukturen und Spleißprozesse13,14,15. Als nächstes ermöglicht die FLGA die Bewertung aller Arten genetischer Varianten beim Spleißen, einschließlich tief intronischer Varianten. Aus diesem Grund haben wir ein Rinder-DGAT1-FLGA erstellt, um die Wirkung von p.M435L und p.K232A auf das Spleißen in einem robusten experimentellen System zu validieren.

Das DGAT1-mRNA-Transkript voller Länge von Exon 1 bis Exon 17 wurde aus der Gesamt-RNA von drei verschiedenen Präparaten nicht transfizierter MAC-T-Zellen unter Verwendung des Primerpaars P1-P2 amplifiziert (Abb. 1A). Ein einzelnes Amplikon, dessen Größe der des gespleißten kanonischen Transkripts entspricht (dh 1220 bp), wurde durch Gelelektrophorese beobachtet (Abb. 1B). Im Gegensatz dazu ergab die Amplifikation der Zielregionen des Transkripts, die die Exons 7 bis 9 und 15 bis 17 abdecken, unter Verwendung der Primerpaare P3-P4 bzw. P5-P2 mehrere Produkte (Abb. 1A, B; ergänzende Abbildung 1). Diese haben eine Größe, die dem gespleißten DGAT1-Transkript entspricht, aber auch der ungespleißten Form und dazwischen teilweise gespleißten Formen. Schließlich zeigte die DGAT1-Genotypisierung von MAC-T-Zellen, dass sie homozygot für p.A232 (c.694GC) und p.M435 (c.1303A) waren (Abb. 1C).

Qualitative RT-PCR-Analyse des endogenen DGAT1-Spleißmusters in MAC-T-Zellen. (A) Abbildung, die die Struktur des Rinder-DGAT1-Gens zeigt. Blaue Kästchen und Linien repräsentieren Rinder-DGAT1-Exons bzw. -Introns. Die Primerpaare P1-P2, P3-P4 und P5-P2 sind rot gekennzeichnet. (B) Gelelektrophorese von P1-P2-, P3-P4- und P5-P2-RT-PCR-Produkten, die aus drei verschiedenen Präparaten von MAC-T-Zellen erhalten wurden. Gespleißte (s) und ungespleißte (u) Produkte sind durch gelbe Pfeile gekennzeichnet und ihre Struktur ist rechts dargestellt. (C) Genotyp der MAC-T-Zellen an den Positionen S.232 und S.435.

Die gesamte Genomsequenz von Rinder-DGAT1, das die Allele p.K232 und p.M435 beherbergt, wurde erfolgreich in den Expressionsvektor pcDNA3.1 (+) eingefügt, um das transfizierte pcDNA3.1-DGAT1 (WT)-Konstrukt zu erhalten (Abb. 2A). sowohl in MAC-T- als auch in humanen embryonalen Nierenzelllinien (HEK293T). Die qualitative RT-PCR, die zur Amplifikation des vollständigen DGAT1-Transkripts verwendet wurde, erzeugte ausnahmslos ein Amplifikat mit einer Größe, die dem erwarteten vollständig gespleißten DGAT1-Transkript in beiden Zelllinien (dh 1450 bp) entsprach (Abb. 2B). Bemerkenswert ist, dass dieses Produkt ausschließlich aus dem pcDNA3.1-DGAT1-Konstrukt stammt, da 5'UTR- und 3'UTR-Teile des Transkripts, auf das die Primer P6 und P7 abzielen, mit dem pcDNA3.1 (+)-Vektor und nicht mit dem Rindergenom verwandt sind , im Gegensatz zu den Primern P1 und P2, die zu Exon 1 bzw. Exon 17 passen.

Validierung des DGAT1 FLGA. (A) Abbildung, die das pcDNA3.1-DGAT1 (WT)-Konstrukt zeigt. Blaue Kästchen und Linien repräsentieren Rinder-DGAT1-Exons bzw. -Introns. Die schwarze Linie stellt das pcDNA3.1 (+)-Rückgrat dar. Das P6-P7-Primerpaar und seine Zielregion sind rot dargestellt. (B) Gelelektrophorese von P6-P7 RT-PCR-Produkten, die aus mit pcDNA3.1-DGAT1 (WT) transfizierten Zellen erhalten wurden.

Die Wirkung der p.M435L-Variante auf das Überspringen von Exon 16 wurde mittels qualitativer RT-PCR untersucht, die die Exons 15 bis 17 umfasste, und an Zellen durchgeführt, die sowohl mit pcDNA3.1-DGAT1 (WT)- als auch mit (M435L)-Konstrukten transfiziert waren (Abb. 3A). ). Die Verwendung der menschlichen HEK293T-Zelllinie wurde der Verwendung der Rinder-MAC-T-Zelllinie vorgezogen. Tatsächlich war die Verwendung einer Nicht-Rinder-Zelllinie die einzige Möglichkeit, die Amplifikation endogener DGAT1-Transkripte zu vermeiden, die die Analyse verzerrt hätte, da PCR-Primer, die zur Amplifikation von DGAT1-Transkripten verwendet werden, ausschließlich Transkripte synthetisieren, die von pcDNA3.1-DGAT1-Konstrukten erzeugt wurden, wie sie sind sind rinderspezifisch.

Qualitative RT-PCR-Analyse von HEK293T-Zellen, die mit pcDNA3.1-DGAT1-Konstrukten (WT oder M435L) transfiziert wurden. (A) Abbildung von Plasmidkonstrukten, die für die qualitative RT-PCR verwendet werden. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) und pcDNA3.1-DGAT1 (M435L) tragen abwechselnd die Allele p.M435 bzw. p.L435. Blaue Kästchen und Linien repräsentieren Rinder-DGAT1-Exons bzw. -Introns. Die schwarze Linie stellt das pcDNA3.1 (+)-Rückgrat dar. Das P5-P2-Primerpaar und seine Zielregion sind rot dargestellt. (B) Gelelektrophorese von P5-P2 RT-PCR-Produkten, die aus HEK293T-Zellen erhalten wurden, die mit pcDNA3.1-DGAT1 (WT oder M435L) transfiziert wurden. Die Struktur der Amplifikate 1 bis 3 ist rechts dargestellt. NT, nicht transfiziert; RT (-), RT-PCR durchgeführt ohne Superscript III. (C) Validierung der Amplikonstruktur aus (B) durch Sanger-Sequenzierung. Es werden nur Exon-Intron- und Exon-Exon-Grenzen angezeigt.

Die RT-PCR ergab mehrere Produkte (Abb. 3B, C; ergänzende Abb. 2), die gereinigt, in den pCR4-TOPO TA-Vektor kloniert und sequenziert wurden. Es wurden drei Haupt-PCR-Produkte identifiziert, die ungespleißten, gespleißten oder Exon-16-übersprungenen Transkripten entsprechen. Exon 16-übersprungene Transkripte wurden sowohl im Zusammenhang mit (WT)- als auch mit (M435L)-Konstrukten beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde das Produkt, das dem korrekt gespleißten Transkript entspricht, ausschließlich für das (WT)-Konstrukt beobachtet.

Der qualitative Effekt der p.K232A-Variante wurde nach dem gleichen Ansatz wie für die p.M435L-Variante untersucht (Abb. 4A). Es wurde kein Unterschied in der Art der beobachteten Transkripte festgestellt, jedoch scheint eines der Produkte bei der p.K232A-Variante in größerer Menge vorhanden zu sein (Abb. 4B, ergänzende Abb. 3). Es entspricht einer intermediären, teilweise gespleißten Form des Transkripts, in der zusätzlich zu den drei amplifizierten Exons noch Intron 7 vorhanden ist (Abb. 4C). Eine sehr schwache und diffuse Bande war bei einem Molekulargewicht von etwas über 100 bp sowohl unter (WT)- als auch unter (K232A)-Bedingungen kaum sichtbar. Es könnte der kleineren alternativen Spleißisoform von DGAT1 entsprechen, die durch die Verwendung einer kryptischen Spleißstelle innerhalb des Exon 8 erzeugt und in früheren Studien beschrieben wurde3,4.

Qualitative RT-PCR-Analyse von HEK293T-Zellen, die mit pcDNA3.1-DGAT1-Konstrukten (WT oder K232A) transfiziert wurden. (A) Abbildung von Plasmidkonstrukten, die für die qualitative RT-PCR verwendet werden. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) und pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) tragen abwechselnd die Allele p.K232 bzw. p.A232. Blaue Kästchen und Linien repräsentieren Rinder-DGAT1-Exons bzw. -Introns. Die schwarze Linie stellt das pcDNA3.1 (+)-Rückgrat dar. Das P3-P4-Primerpaar und seine Zielregion sind rot dargestellt. (B) Gelelektrophorese von P3-P4 RT-PCR-Produkten, die aus HEK293T-Zellen erhalten wurden, die mit pcDNA3.1-DGAT1 (WT oder K232A) transfiziert wurden. Die Struktur der Amplifikate 1 bis 3 ist rechts dargestellt. NT, nicht transfiziert; RT (-), RT-PCR durchgeführt ohne Superscript III. (C) Validierung der Amplikonstruktur aus (B) durch Sanger-Sequenzierung. Es werden nur Exon-Intron- und Exon-Exon-Grenzen angezeigt.

In der vorherigen Studie von Fink et al. wurde gezeigt, dass die p.K232A-Variante das Spleißen von Intron 7 deutlich verringert und es wurde auch vermutet, dass sie das Spleißen von Intron 2 verändert. Aus diesem Grund haben wir eine quantitative RT-PCR entwickelt, um den relativen Anteil zu bestimmen Expression von gespleißten und ungespleißten Transkripten an den Verbindungsstellen 2 und 7 (Abb. 5A, B). Wir haben auch Anschluss 1 analysiert, da er als Anschluss 2 nicht in die Studie von Fink et al. einbezogen wurde. aufgrund technischer Einschränkungen. Die MAC-T-Zelllinie wurde für die Durchführung des Experiments ausgewählt, da die quantitative RT-PCR im Gegensatz zur qualitativen RT-PCR die Quantifizierung und Entfernung der endogenen DGAT1-Expression ermöglicht (Abb. 5A). Die Konstrukte pcDNA3.1-DGAT1 (WT) und (K232A) wurden parallel analysiert, um den durchschnittlichen Prozentsatz des Spleißens, die mittlere Expression gespleißter Transkripte und die mittlere Expression nicht gespleißter Transkripte für jede Verbindungsstelle 1, 2 und 7 zu bestimmen (Abb. 5C). Für diese drei Parameter wurden unabhängig vom getesteten Allel Unterschiede zwischen den Verbindungen beobachtet, was zeigt, dass die Verbindungen 1, 2 und 7 unterschiedliche Spleißeffizienzen aufwiesen. Im Gegensatz dazu haben wir bei der Betrachtung einer bestimmten Kreuzung für keinen dieser Parameter einen signifikanten Unterschied zwischen den (WT)- und (K232A)-Bedingungen festgestellt.

Quantitative RT-PCR-Analysen von MAC-T-Zellen, die mit pcDNA3.1-DGAT1-Konstrukten (WT oder K232A) transfiziert wurden. (A) Experimenteller Arbeitsablauf eines quantitativen RT-PCR-Experiments. (B) Darstellung von Plasmidkonstrukten, die für die quantitative RT-PCR verwendet werden. pcDNA3.1-DGAT1 (WT) und pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) tragen abwechselnd die Allele p.K232 bzw. p.A232. Blaue Kästchen und Linien repräsentieren Rinder-DGAT1-Exons bzw. -Introns. Die schwarze Linie stellt das pcDNA3.1 (+)- oder pcAT7-Glo1-Rückgrat dar. Primerpaare werden in Rot angezeigt, wenn sie auf Exon-Exon-Grenzen abzielen, und in Grün, wenn sie auf Exon-Intron-Grenzen abzielen. Weitere Einzelheiten finden Sie in den Materialien und Methoden sowie in Tabelle 1. (C) Durchschnittlicher Prozentsatz des Spleißens, mittlere Expression gespleißter Transkripte und mittlere Expression ungespleißter Transkripte für Verbindungsstelle 1 (J1), Verbindungsstelle 2 (J2) und Verbindungsstelle 7 (J7), berechnet aus drei unabhängigen Transfektionsexperimente wurden dreifach durchgeführt. Balken, SD. Die relative Expression, die der endogenen DGAT1-Expression und der DNA-Kontamination zugeschrieben wird, wurde von den in der Testbedingung RT (+) erhaltenen Werten abgezogen, um den hier dargestellten endgültigen relativen Ausdruck zu berechnen. Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen den Bedingungen (WT) und (K232A) in (A, B und C) beobachtet.

Um den zuverlässigsten Assay zu entwickeln, haben wir zwei technische Vorurteile berücksichtigt, die die Genauigkeit quantitativer RT-PCR-Experimente beeinträchtigen können: i) die endogene Expression von DGAT1 und ii) die Kontamination von RNA-Proben durch Plasmid-DNA. Der mittlere relative Beitrag dieser beiden Fehlerquellen zur unter Testbedingungen gemessenen relativen Expression betrug unabhängig von der betrachteten quantitativen RT-PCR weniger als 5 % (Abb. 6). Wie im Abschnitt „Material und Methoden“ erläutert, wurde die relative Expression, die der endogenen DGAT1-Expression und der DNA-Kontamination zugeschrieben wird, von den in der Testbedingung RT (+) erhaltenen Werten abgezogen, um den in Abb. 5C dargestellten korrigierten relativen Ausdruck zu erhalten.

Mittlerer relativer Beitrag der endogenen DGAT1-Expression und der Plasmid-DNA-Kontamination zur relativen Expression, gemessen durch quantitative RT-PCR unter der Testbedingung RT (+), berechnet aus drei unabhängigen Transfektionsexperimenten, die in dreifacher Ausfertigung durchgeführt wurden. Gespleißte Verbindung (S), ungespleißte Verbindung (U). Balken, SD.

DGAT1 ist aufgrund seiner vorherrschenden Rolle bei den Milchphänotypen eines der am besten untersuchten Gene in der Rindergenetik. Allerdings wurden bisher nur zwei Funktionsverlustvarianten von DGAT1 bei Rindern beschrieben. Die Varianten p.K232A und p.M435L wurden mit Spleißdefekten in vivo in Verbindung gebracht4,5. Ihre Spleißogenität wurde jedoch noch nicht in einem robusten experimentellen System validiert. Wir haben ein DGAT1 FLGA entwickelt, um die Auswirkung dieser Varianten auf das Spleißen zu validieren, da es unseres Wissens nach das zuverlässigste System für diese Art von Analyse ist. Da p.M435L in vivo zum Überspringen von Exon 16 führte, verwendeten wir das FLGA auf qualitative Weise, um die Sequenz des DGAT1-Transkripts in der Region von Exon 15 bis Exon 17 zu analysieren. Das DGAT1-Transkript wurde aus pcDNA3.1-DGAT1 generiert (WT)-Konstrukt trug Exon 16 und die Einführung der p.M435L-Variante in das Konstrukt führte zum vollständigen Überspringen dieses Exons. In der In-vivo-Studie von Lehnert et al. wurde bei Rindern, die homozygot für p.M435L waren, eine sehr kleine Menge normal gespleißter Transkripte nachgewiesen, was ein Ergebnis war, das mit dem vergleichbar war, was wir in unserem System erhalten haben5. Dies bestätigte die Wirkung der p.M435L-Variante und unterstützte die Verwendung der FLGA-Methode zur Analyse anderer DGAT1-Spleißvarianten. Unter Verwendung des FLGA beobachteten wir auch das Vorhandensein des Exon 16-übersprungenen Transkripts in geringer Menge im (WT)-Zustand, was in vivo nicht beobachtet wird. Dies zeigt, dass, obwohl die FLGA-Methode die Untersuchung einer Variante im Kontext der vollständigen Transkriptsequenz ermöglicht, Unterschiede zwischen den Spleißmustern des endogenen Transkripts und dem mit FLGA erhaltenen Transkript bestehen bleiben können. Generell gilt: Wenn ein FLGA-System nicht das erwartete Transkript generiert oder unerwartete Transkripte in zu großen Mengen generiert, empfehlen wir, es nicht zu verwenden.

Die anschließende qualitative Analyse der p.K232A-Variante ergab ein etwas anderes Spleißmuster für diese Variante im Vergleich zum WT-Zustand. Eine teilweise gespleißte Form des Transkripts mit Beibehaltung des Introns 7 wurde in größerer Menge für die p.K232A-Variante beobachtet. Diese erste Beobachtung stimmte mit der Hypothese von Fink et al. überein. dass die p.K232A-Variante die Spleißrate der Verbindungsstelle 7 verringert, jedoch wurde kein Unterschied zwischen den WT- und p.K232A-Bedingungen in Bezug auf das normal gespleißte Produkt mit den Exons 7 bis 9 beobachtet. Dieser letzte Punkt stand im Widerspruch zu den Ergebnissen von Fink et al. Andererseits müssen wir bedenken, dass die qualitative RT-PCR keine präzise Quantifizierung der amplifizierten Produkte ermöglicht. Daher war es notwendig, eine quantitative RT-PCR zu entwickeln, um dieses Problem zu lösen, wie von Fink et al. durchgeführt .

Thus, we attempted to replicate the most compelling result from the Fink et al. study which was the decrease in the splicing rate of junction 7 caused by the p.K232A variant4. The possible effects on the splicing of introns 1 and 2 were also tested. In a manner comparable to theirs, we have set up quantitative RT-PCR and we have measured DGAT1 spliced and unspliced transcripts relative expression at each junction, as the average percentage of splicing, in MAC-T cells transfected with pcDNA3.1-DGAT1 constructs. We did not observe any significant difference between (WT) and (K232A) conditions on any splicing parameters related to junction 1, 2 or 7. Conversely, the minigene assay developed by Fink et al. showed a 4-fold increase in terms of spliced transcript relative expression for the p.K232 allele by comparison to the p.A232 allele in the context of the junction 7, what resulted in a dramatic rise of intron 7 splicing ratio. Such a strong discordance may seem a little surprising but it can be explained by differences in terms of methodological choices or technical considerations between both studies. First, and as we have mentioned in the introduction, using a truncated or chimeric genomic sequence of a gene to perform episomal splicing reporter assays is less reliable than using the full gene sequence. A minigene harbouring all exons of a gene but lacking several of its introns as used by Fink et al. may generate strong false positives. This kind of bias has been unmasked by Wu et al., who used FLGA to analyse the human SPINK1 c.194G>A variant previously classified as strongly spliceogenic using minigene assayA variant on pre-mRNA splicing. Gut 66, 2195–2196 (2017)." href="/articles/s41598-023-36142-z#ref-CR6" id="ref-link-section-d226774577e945"> 6,16. Sie zeigten, dass diese Variante tatsächlich keinen Einfluss auf das Spleißen hatte. In der Folge wurde auch erkannt, dass zelllinienbasierte Experimente unter mangelnder Reproduzierbarkeit leiden können, insbesondere wenn sie von verschiedenen Experimentatoren, in verschiedenen Labors und unter Verwendung unterschiedlicher Zellpräparate durchgeführt werden17. Dies könnte zu widersprüchlichen Ergebnissen zwischen unserer Studie und der von Fink et al. beigetragen haben.

Wir kamen zu dem Schluss, dass diese Variante selbst keinen wesentlichen Einfluss auf das Spleißen der DGAT1-Verbindungen 1, 2 und 7 hatte. Ansonsten stimmen unsere Ergebnisse mit der Tatsache überein, dass die in vivo beobachteten Variationen in Bezug auf Expression und Spleißeffizienz sehr gering sind und in der Größenordnung von einigen Prozent liegen4. Solche kleinen Abweichungen können durch quantitative RT-PCR möglicherweise nicht erkannt werden. Wir gehen davon aus, dass die p.K232A-Variante wahrscheinlich einen geringen Einfluss auf das Spleißen selbst hat, was sowohl durch die Tatsache gestützt wird, dass sie sich in einem exonischen Spleißverstärker4 befindet, als auch dadurch, dass wir durch qualitative RT-PCR-Analyse einen möglichen Effekt beobachtet haben, der aber bleibt im Vergleich zu seiner Wirkung auf die Proteinfunktion relativ anekdotisch. Wie oben angedeutet, ist der von Fink et al. beobachtete sehr starke Effekt dieser Variante auf das Spleißen von Knotenpunkt 7. in ihrem Minigensystem war wahrscheinlich ein Artefakt im Zusammenhang mit nicht optimalen methodischen Entscheidungen.

Die letzte in unserer Arbeit behandelte Frage betraf die Relevanz der Überprüfung der Auswirkungen bestimmter technischer Verzerrungen bei der Verwendung von Minigen-Assays oder FLGA. Abhängig vom RT-PCR-Design kann die spezifische Quantifizierung der von einem Expressionsplasmid produzierten mRNA aufgrund i) einer Verwechslung zwischen endogener und episomaler Expression des Zielgens und ii) einer Kontamination der Gesamt-RNA durch Plasmid-DNA18 ein Problem darstellen. Die Interferenz zwischen endogenen und episomalen Ausdrücken kann auf zwei Arten vermieden werden. Erstens durch die Verwendung artspezifischer Primer zur ausschließlichen Amplifikation des Ziels aus dem Plasmidkonstrukt in Kombination mit einer Zelllinie einer anderen, aber genetisch eng verwandten Art, wie wir es für p.M435L getan haben. Alternativ kann eine Zelllinie verwendet werden, in der das Zielgen überhaupt nicht exprimiert wird. Die Verwendung einer Zelllinie, die aus einem anderen Gewebe oder einer anderen Spezies als dem Zielgen stammt, ist nicht wirklich fraglich, da der Spleißcode zwischen eng verwandten Spezies stark konserviert ist19 und Zelllinien, die aus verschiedenen Organen isoliert wurden, dies größtenteils zeigten die zeitlich vergleichbaren Ergebnisse bei der Durchführung von Spleiß-Reporter-Assays20. Beispielsweise wurden die HEK293T-Zellen erfolgreich zur Analyse von Hunderten von Varianten in Dutzenden von Genen verwendet, die in vielen verschiedenen Geweben exprimiert werden, mithilfe von Minigen- und Midigen-Assays oder FLGA (Beispiele finden Sie in den in der Einleitung zitierten Referenzen oder21,22,23). Außerdem haben wir gezeigt, dass die Plasmidkontamination durch die DNase-Behandlung auf ein akzeptables Maß gesenkt werden kann. Eine weitere Möglichkeit, jegliche Amplifikation kontaminierender Plasmid-DNA zu vermeiden, besteht darin, RT-PCR-Primer nur auf Exons zu entwerfen, die durch ausreichend lange Introns getrennt sind. Dies ist jedoch nicht immer möglich24. Unter den experimentellen Bedingungen, die wir zur Durchführung einer quantitativen RT-PCR in MAC-T-Zellen verwendeten, machten die endogene Expression und die Plasmidkontamination zusammengenommen durchschnittlich weniger als 5 % der relativen DGAT1-Expression aus. Diese Kontamination ist als gering einzustufen und stellt keine wesentliche Fehlerquelle dar. Wir hätten es bei der Berechnung des relativen DGAT1-Ausdrucks ignorieren können, ohne dass es die Ergebnisse wesentlich verändert hätte. Dennoch sind wir der Meinung, dass sich jeder darüber im Klaren sein sollte, bevor er mit einem Minigen- oder FLGA-Assay beginnt, und diesen Grad der Kontamination quantifizieren sollte, wenn das RT-PCR-Design wahrscheinlich eine Amplifikation endogener Transkripte oder kontaminierender Plasmide ermöglicht. Wenn diese Verunreinigungen hoch sind, kann dies die Zuverlässigkeit der Ergebnisse beeinträchtigen. Abschließend ist es wichtig zu präzisieren, dass die Plasmidkontamination ein Problem darstellt, das auch bei der Durchführung qualitativer RT-PCR berücksichtigt werden muss. Bei solchen RT-PCRs ist es nicht möglich, die Kontamination zu quantifizieren und vom interessierenden Signal abzuziehen, wie wir es bei quantitativen RT-PCRs getan haben. Daher ist es notwendig, zusätzliche Anstrengungen zu unternehmen, um alle Spuren einer Plasmid-DNA-Kontamination in den RNAs zu beseitigen, beispielsweise durch einen zusätzlichen Schritt der DNAse-Behandlung.

Als Schlussbemerkung empfehlen wir die Verwendung der FLGA-Methode zur Analyse spleißogener Varianten, da es sich um den robustesten episomalen Spleißreporter-Assay handelt, insbesondere zur Analyse hypomorpher Spleißvarianten oder Varianten mit komplexen Mechanismen. Natürlich bleibt der Minigen-Assay immer noch ein nützliches Werkzeug, das in Kombination mit komplementären funktionellen, genetischen und phänotypischen Daten in vielen Situationen gut passt.

Ein 8218-bp-Fragment, das die DGAT1-Genomsequenz vom Ende des ersten Exons bis zum Anfang des letzten Exons (chr14: 604.331–612.548) enthält, wurde aus einer genomischen DNA-Probe von Rindern amplifiziert. Es wurde von einer Holstein-Kuh gewonnen, die die Variante DGAT1 p.K232A im heterozygoten Zustand trug und zuvor das gesamte Genom sequenziert wurde25. Die Long-Range-PCR wurde mit 100 ng DNA in einem 50-µL-Reaktionsgemisch durchgeführt, das auf Eis zubereitet wurde und 25 µL 2X KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Roche) und jeweils 0,3 µM Primer C1 und C2 enthielt (Tabelle 1). Das PCR-Programm umfasste eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 3 Minuten, 32 Denaturierungszyklen bei 98 °C für 20 Sekunden, ein Annealing bei 70 °C für 15 Sekunden, eine Verlängerung bei 72 °C für 8 Minuten und 30 Sekunden und ein Finale Verlängerungsschritt bei 72 °C für 1 Minute. Die Amplikons wurden mit dem QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen) gereinigt. Das pcDNA3.1(+)-Expressionsplasmid wurde mit BamHI und Mehrere aus diesem Prozess resultierende Konstrukte wurden durch Sanger-Sequenzierung analysiert, um die Sequenz an den Positionen S.232 und S.435 zu überprüfen. Ein Plasmid, das die Allele p.K232 und p.M435 trägt, wurde als pcDNA3.1-DGAT1 (WT)-Konstrukt ausgewählt und anschließend mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) oder dem NucleoBond Xtra Midi EF (Masherey Nagel) hergestellt und mit quantifiziert ein NanoDrop™ One (Thermo Scientific). Abschließend wurde das Konstrukt durch doppelten Verdau mit BamHI und XhoI validiert und die Sequenz des in das Konstrukt eingefügten DGAT1-Gens sowie die der zum Klonen verwendeten genomischen DNA wurden durch Sanger-Sequenzierung vollständig verifiziert. Während des PCR-Amplifikationsschritts wurden zwei unerwünschte Mutationen in das Konstrukt eingeführt (z. B. BTA14:607550C>T, BTA14:608021C>T), die sich jedoch außerhalb der Spleißstellen und weit entfernt von den beiden untersuchten Varianten befanden.

Die Varianten DGAT1 p.M435L (c.1303A>C) und p.K232A (c.694AA>GC) wurden mithilfe des QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent) in das pcDNA3.1-DGAT1 (WT)-Konstrukt eingeführt Technologien). Die Mutagenese wurde in einer 51-μl-Mischung durchgeführt, die 2,5 U PfuUltra HF-DNA-Polymerase, 1 μl dNTP-Mix, 5 μl 10-fach-Reaktionspuffer, 3 μl QuikSolution, 20 ng pcDNA3.1-DGAT1 und jeweils 125 ng Mutageneseprimer M1 und M2 enthielt alternativ M3 und M4 (Tabelle 1). Das PCR-Programm umfasste eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 1 Minute, gefolgt von 18 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 50 Sekunden, Annealing bei 60 °C für 50 Sekunden und Verlängerung bei 68 °C für 28 Minuten und a letzte Verlängerung bei 68 °C für 7 Min. Das Post-PCR-Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde lang bei 37 °C mit DpnI behandelt, dann wurden 4 µL der resultierenden Produkte in XL10-Gold Ultracompetent-Zellen (Agilent Technologies) transformiert. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Ampicillin ausgebreitet, dann wurden mehrere ausgewählte Kolonien verwendet, um Miniprep-Plasmidproduktionen mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) vorzubereiten. Miniprep-Plasmide wurden mittels Sanger-Sequenzierung analysiert, um die erfolgreiche Einführung der gewünschten Substitution zu verifizieren, und für jede Variante wurde eine groß angelegte NucleoBond Xtra Midi EF-Plasmidproduktion durchgeführt und quantifiziert. Konstrukte, die die Varianten p.M435L und p.K232A enthielten, wurden pcDNA3.1-DGAT1 (M435L) bzw. pcDNA3.1-DGAT1 (K232A) genannt.

HEK293T-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) (Gibco) mit 10 % fötalem Kälberserum (Sigma Aldrich) kultiviert. MAC-T-Zellen wurden in DMEM mit 10 % fötalem Kälberserum, ergänzt mit 4 mM L-Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 µg/L Hydrocortison und 50 mg/L Insulin, kultiviert. Vierundzwanzig Stunden vor der Transfektion wurden 3 × 105 Zellen pro Vertiefung in Platten mit sechs Vertiefungen ausgesät. Für die qualitative Analyse der Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurden 1 μg pcDNA3.1-DGAT1 (WT oder M435L)-Plasmide verwendet, die mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit extrahiert und mit 3 μl Lipofectamine 2000-Transfektionsreagenz (Invitrogen) gemischt wurden Transfektion pro Well. Für quantitative RT-PCR-Analysen in Echtzeit wurde pcDNA3.1-DGAT1 (WT oder K232A) mit pcAT7-Glo1 im äquimolaren Verhältnis gemischt, um eine Gesamtmenge von 1 µg zu erreichen, und dann mit 3 µL Lipofectamine 2000-Transfektionsreagenz gemischt. Die für die quantitative RT-PCR verwendeten Plasmide wurden alle mit NucleoBond Xtra Midi EF extrahiert. Der in dieser Studie verwendete pcAT7-Glo1-Vektor wurde von Scott I. Adamson und Brenton R. Graveley von der University of Connecticut bereitgestellt und war die modifizierte Version des Plasmids, bei dem eine Spleißakzeptorstelle in der Mitte von Intron 1 entfernt wurde20 . Für die Hintergrundkontrollbedingung wurde pcDNA3.1-DGAT1 durch das leere Plasmid pcDNA3.1 (+) unter Verwendung derselben molaren Mengen ersetzt. Bemerkenswert ist, dass der Mischung pGL3-basisches Plasmid (Promega) zugesetzt wurde, um die Endmenge von 1 µg konstant zu halten, da pcDNA3.1 (+) ein niedrigeres Molekulargewicht als pcDNA3.1-DGAT1 hatte. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurde die Gesamt-RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen) extrahiert, indem eine DNase-Behandlung auf der Säule hinzugefügt wurde. RNAs, die für eine qualitative RT-PCR vorgesehen sind und einer Plasmidkontamination ausgesetzt sind (z. B. RT-PCR P5-P2 und P3-P4, durchgeführt im Kontext von FLGA; siehe unten für eine Beschreibung des RT-PCR-Designs), wurden einer zusätzlichen RNA-Bereinigung unterzogen Schritt mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen). Die RT wurde mit dem SuperScript III First-Strand Synthesis System für RT-PCR (Invitrogen) mit 1 µg RNA, 2,5 µM Oligo(dT) 20, jeweils 500 µM dNTP, 5 mM MgCl2, 5 mM Dithiothreitol, 40 U RNaseOUT und 200 durchgeführt U Superscript III gemäß den Anweisungen des Herstellers. Alternativ wurden nur 100 ng RNA für die im Rahmen von FLGA durchgeführte qualitative RT-PCR P5-P2 und P3-P4 verwendet. Komplementäre DNA (cDNA) wurde mit 2 U RNaseH (Invitrogen) abgebaut. Für jede RNA-Probe wurde eine Negativkontrolle ohne SuperScript III-Enzym durchgeführt, um die DNA-Kontamination innerhalb der gesamten RNA-Proben zu beurteilen.

Grundsätzlich wurde eine qualitative RT-PCR in einem 50-µL-Reaktionsgemisch durchgeführt, das 1,25 µL GoTaq® DNA-Polymerase (Promega), 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, 0,5 µM Primerpaare „P“, wie in Tabelle 1 beschrieben, und 2 µL cDNA enthielt. Beachten Sie, dass 5 µL cDNA für die qualitative RT-PCR P5-P2 und P3-P4 verwendet wurden, die im Rahmen von FLGA durchgeführt wurde. Die Primerpaare P1-P2, P3-P4, P5-P2 und P6-P7 wurden verwendet, um Regionen zu amplifizieren, die die Exons 1 bis 17, Exons 7 bis 9, Exons 15 bis 17 bzw. pcDNA3.1 5'UTR bis 3'UTR umfassen . Das PCR-Programm umfasste eine anfängliche Denaturierung bei 95 °C für 2 Minuten, gefolgt von 30 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 Sekunden, Annealing bei 58 °C für 30 Sekunden, Verlängerung bei 72 °C für 1 Minute und 30 Sekunden ein letzter Verlängerungsschritt bei 72 °C für 5 Minuten. Die Haupt-PCR-Produkte wurden gelgereinigt und gemäß den Anweisungen des Herstellers in den pCR4-TOPO TA-Vektor (Invitrogen) kloniert. Die Klonsequenz, die jedem zu identifizierenden Transkript entspricht, wurde dann durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung der Universalprimer M13 vorwärts und rückwärts überprüft.

Die Gesamt-RNA, die aus MAC-T-Zellen extrahiert wurde, die sowohl mit pcDNA3.1-DGAT1 als auch mit pcAT7-Glo1 co-transfiziert waren, wurde durch quantitative RT-PCR analysiert. pcAT7-Glo1 wurde als Referenzgen verwendet, um die relative Expression von gespleißten oder nicht gespleißten Verbindungen von Transkripten, die von pcDNA3.1-DGAT1 stammen, gemäß dem effizienzkorrigierten Berechnungsmodell von Pfaffl zu berechnen26. Wie in Abb. 5B und in Tabelle 1 beschrieben, wurde die Expression gespleißter DGAT1-Transkripte mithilfe von Primerpaaren quantifiziert, die sich über zwei aufeinanderfolgende Exons erstrecken, nämlich Q1 in Exon 1 und Q2 in Exon 2 für Verbindungsstelle 1, Q4 in Exon 2 und Q5 in Exon 3 für Verbindung 2, zusätzlich zu Q7 in Exon 7 und Q8 in Exon 7/8 für Verbindung 7. Die Expression ungespleißter DGAT1-Transkripte wurde unter Verwendung von Primerpaaren quantifiziert, die sich über ein Exon und das folgende Intron erstrecken, d. h. Q1 in Exon 1 und Q3 in Intron 1 für Verbindungsstelle 1, Q4 in Exon 2 und Q6 in Intron 2 für Verbindungsstelle 2, zusätzlich zu Q7 in Exon 7 und Q9 in Intron 7 für Verbindungsstelle 7. Um experimentelle Verzerrungen zu vermeiden, erfolgt die endogene Expression von MAC-T DGAT1 aus Zellen, die mit leerem pcDNA3 transfiziert wurden .1 (+) wurde in jedem Transfektionsexperiment parallel gemessen und von denen von pcDNA3.1-DGAT1 abgezogen, um das Hintergrundsignal zu eliminieren (Abb. 5A). Darüber hinaus wurde die RT-PCR-Negativkontrolle RT (-) verwendet, um die mutmaßliche Plasmid-DNA-Kontamination in jeder unter den Testbedingungen verwendeten RNA-Probe zu bewerten und sie von der im RT (+)-Experiment gemessenen relativen DGAT1-Expression abzuziehen der Testbedingung. Es wurde durch die Durchführung der DGAT1 RT-PCR ohne das Superscript III-Enzym erhalten. Nach der Durchführung von DGAT1-PCRs an RT (-)-Proben erfolgte die Berechnung der durch Plasmidkontamination in jeder RNA-Probe erzeugten relativen DGAT1-Expression durch Expression des DGAT1-Signals aus dem RT (-)-Experiment im Verhältnis zum Referenzsignal aus der entsprechenden RT ( +) experimentieren. Anschließend wurde die resultierende relative DGAT1-Expression, die die Plasmid-DNA-Kontamination darstellt, von der DGAT1-RT-PCR subtrahiert, bei der die relative Expression gespleißter und nicht gespleißter Transkripte unter RT (+)-Testbedingungen bewertet wurde, um die in Abb. 5C dargestellte korrigierte relative DGAT1-Expression zu erhalten. Schließlich wurde der durchschnittliche Prozentsatz des an einer bestimmten Verbindungsstelle beobachteten Spleißens ermittelt, indem die mittlere Expression der gespleißten Transkripte durch die mittlere Gesamtexpression der Transkripte dividiert wurde. Drei unabhängige Transfektionsexperimente wurden für jede Bedingung dreifach analysiert, und der beobachtete Unterschied zwischen pcDNA3.1-DGAT1 (WT) und (K232A) in jeder Art von Analyse wurde durch den Student-t-Test mit einem Schwellenwert von p < 0,05 auf Signifikanz beurteilt.

Technisch gesehen wurde die quantitative RT-PCR dreifach auf einem QuantStudio 12k Flex (Applied Biosystems) durchgeführt. Das Reaktionsgemisch enthielt 10 µL SYBR™ Master Mix PCR Power SYBR™ Green (Applied Biosystems), 0,6 µM Primerpaare „Q“, wie in Tabelle 1 und Abb. 5B beschrieben, und 5 µL 40-fach verdünnte cDNA im Gesamtvolumen von 20 µL. Das PCR-Programm umfasste einen ersten Schritt bei 50 °C für 2 Minuten und einen zweiten Schritt bei 95 °C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und Annealing und Extension bei 60 °C für 1 Mindest. Anschließend folgte ein Schmelzkurvenprogramm bestehend aus 95 °C für 15 s, 60 °C für 1 min und 95 °C für 15 s.

Ein Pellet mit 1,5 Millionen MAC-T-Zellen wurde zur DNA-Extraktion mit dem Puregene Cell & Tissue Kit (Qiagen) verwendet. Genomregionen, die sich über die Exons 7 bis 9 und 15 bis 17 von DGAT1 erstrecken, wurden durch PCR aus dieser DNA unter Verwendung der Primerpaare P3-P4 bzw. P5-P2 unter den gleichen Bedingungen wie oben in „Qualitative RT-PCR“ beschrieben amplifiziert. Die resultierenden Amplikons wurden durch Sanger-Sequenzierung unter Verwendung derselben Primer analysiert, um den MAC-T-Genotyp an den Positionen p.232 und p.435 des DGAT1-Gens zu bestimmen.

Die Autoren bestätigen, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Artikel verfügbar sind.

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Der pcAT7-Glo1-Vektor war ein freundliches Geschenk von Scott I. Adamson und Brenton R. Graveley von der University of Connecticut. Die HEK293T-Zelllinie war ein freundliches Geschenk von Sophie Dhorne-Pollet von der GABI-Einheit des INRAE.

Universität Paris-Saclay, INRAE, AgroParisTech, GABI, 78350, Jouy-en-Josas, Frankreich

Nicolas Gaiani, Lorraine Bourgeois-Brunel, Dominique Rocha und Arnaud Boulling

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NG und AB: haben diese Studie konzipiert und gestaltet. NG und LBB: führten die Experimente durch. NG, DR und AB: analysierten die Daten. AB: Schreiben – ursprüngliche Entwurfsvorbereitung. NG, DR und AB: Schreiben – Rezension und Bearbeitung. Alle Autoren haben die veröffentlichte Version des Manuskripts gelesen und ihr zugestimmt.

Korrespondenz mit Arnaud Boulling.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gaiani, N., Bourgeois-Brunel, L., Rocha, D. et al. Analyse des Einflusses der DGAT1-Varianten p.M435L und p.K232A auf das Prä-mRNA-Spleißen in einem Volllängen-Gen-Assay. Sci Rep 13, 8999 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36142-z

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Eingegangen: 11. Januar 2023

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36142-z

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