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Aug 06, 2023

H2O2 schädigt selektiv das zweikernige Eisen

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 7652 (2023) Diesen Artikel zitieren

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NADH: Ubiquinonoxidoreduktase, Atmungskomplex I, spielt eine wichtige Rolle im zellulären Energiestoffwechsel, indem es den Elektronentransfer mit der Protonentranslokation koppelt. Der Elektronentransfer wird durch ein Flavinmononukleotid und eine Reihe von Eisen-Schwefel-Clustern (Fe/S) katalysiert. Als Nebenprodukt der Reaktion erzeugt das reduzierte Flavin reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Es wurde vermutet, dass die von der Atmungskette im Allgemeinen erzeugten ROS die Fe/S-Cluster des Komplexes schädigen könnten. Hier zeigen wir, dass der zweikernige Fe/S-Cluster N1b durch H2O2 gezielt geschädigt wird, allerdings nur bei hohen Konzentrationen. Unter den gleichen Bedingungen wird die Aktivität des Komplexes jedoch kaum beeinträchtigt, da N1b beim Elektronentransfer leicht umgangen werden kann.

Die energieumwandelnde NADH:Ubiquinon-Oxidoreduktase, Atmungskomplex I, spielt eine wichtige Rolle in der zellulären Bioenergetik, indem sie die NADH-Oxidation und Ubichinon (Q)-Reduktion mit der Translokation von Protonen durch die Membran koppelt1,2,3,4,5,6. Es besteht aus einem peripheren Arm, der den Elektronentransfer katalysiert, und einem Membranarm, der für die Protonentranslokation verantwortlich ist. Die beiden Arme sind nahezu senkrecht zueinander angeordnet, wodurch sich eine L-förmige Struktur des Komplexes ergibt. Der Mitochondrienkomplex I besteht aus 45 Untereinheiten, darunter 14 Kernuntereinheiten, die in allen Arten vorkommen, die eine energieumwandelnde NADH:Q-Oxidoreduktase enthalten7,8. Die dreidimensionale Struktur der Kernuntereinheiten von Komplex I bleibt von Bakterien bis zu Säugetieren erhalten9,10. Der Bakterienkomplex von Escherichia coli besteht aus 13 verschiedenen Untereinheiten mit den Namen NuoA bis NuoN, von denen zwei mit der einzelnen Untereinheit NuoCD11 fusioniert sind. Sie werden von den Nuo-Genen kodiert und summieren sich auf eine Molekülmasse von etwa 530 kDa12.

NADH wird an der Spitze des peripheren Arms durch Hydridtransfer zum primären Elektronenakzeptor Flavinmononukleotid (FMN)13 oxidiert. Von hier aus werden Elektronen über eine Distanz von etwa 100 Å über eine Reihe von sieben Eisen-Schwefel-Clustern (Fe/S) zur Membran übertragen, wo Q in einem spezifischen Bindungshohlraum, der aus Untereinheiten der besteht, reduziert und protoniert wird peripher und der Membranarm1,2,3,4,5,6. Es wird angenommen, dass sich AQ-Spezies von einer Bindungsstelle mit hoher Energie zu einer Bindungsstelle mit niedriger Energie innerhalb des Hohlraums bewegen und dabei elektrostatische und Konformationsänderungen verursachen, die die Protonentranslokation im Membranarm vorantreiben2,14,15,16. Der Membranarm enthält vier mutmaßliche Protonenpfade, die durch eine zentrale Achse geladener Reste miteinander und mit dem Q-Hohlraum verbunden sind. Es wurde vorgeschlagen, dass die Bewegung der Q-Spezies in ihrem Hohlraum die Ausbreitung einer „elektrischen“ Welle induziert, die sich durch den Membranarm hin und her bewegt und so die Protonentranslokation auslöst16. Alternativ wurde vorgeschlagen, dass die Bindung von Chinon zu einem Übergang von einem „offenen“ in einen „geschlossenen“ Zustand führt10. Die Chinonreduktion führt zu einer Umverteilung der Protonen im Membranarm, was wiederum zu einer Protonenabgabe an das Zytoplasma ausschließlich in NuoL10 führt.

Die NADH-Oxidation durch Komplex I ist mit der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) wie Superoxid und Wasserstoffperoxid verbunden17,18,19,20 was zum zellulären Stress beiträgt21. Es ist allgemein anerkannt, dass die durch Komplex I erzeugten ROS ihren Ursprung im reduzierten FMN17,18,19,20 haben. Etwa 0,1–2 % des oxidierten NADH führen in vitro zur ROS-Produktion22,23,24,25. ROS tragen nicht nur zu oxidativen Schäden wie Lipidperoxidation, Proteinabbau und DNA-Oxidation bei, sondern stellen auch wesentliche Redoxsignale dar26,27,28,29.

Der ROS-produzierende FMN-Cofaktor befindet sich in unmittelbarer Nähe der Fe/S-Cluster des Atmungskomplexes I. Es ist bekannt, dass lösungsmittelexponierte Fe/S-Cluster anfällig für oxidative Schäden sind30,31. Die Strukturen von Komplex I aus verschiedenen Organismen zeigen, dass seine Fe/S-Cluster größtenteils vom Lösungsmittel abgeschirmt sind und daher vor dem Abbau durch ROS7,8,9,10,32,33,34,35,36 geschützt werden sollten. Dennoch wurde vermutet, dass eine erhöhte ROS-Produktion durch Komplex I und die Atmungskette im Allgemeinen zu einer Schädigung der Fe/S-Cluster von Komplex I37 führen könnte. Hier haben wir den E. coli-Komplex I verwendet, um diesen Vorschlag zu testen. Da es sich um eine strukturelle Minimalform des mitochondrialen Komplexes I handelt, fehlen dem aus E. coli die zusätzlichen akzessorischen Untereinheiten, die den katalytischen Kern umgeben. Daher könnten die Fe/S-Cluster des E. coli-Komplexes I anfälliger für oxidative Schäden sein als ihre Homologen im mitochondrialen Komplex I. Da bekannt ist, dass E. coli-Komplex I ROS hauptsächlich in Form von H2O238,39 produziert, haben wir untersuchten den Einfluss von H2O2 auf die Aktivität von Komplex I und seine Fe/S-Clusterzusammensetzung. Es stellte sich heraus, dass millimolare H2O2-Konzentrationen erforderlich sind, um die NADH-Oxidase-Aktivität zu hemmen. Während die NADH:Decyl-Ubichinon-Aktivität des isolierten Komplexes in Gegenwart von 1 mM H2O2 unverändert bleibt, zeigen wir mithilfe der EPR-Spektroskopie direkt, dass die Behandlung mit 1 mM H2O2 zu einem selektiven Verlust des Fe/S-Clusters N1b auf der Untereinheit NuoG führt.

Aufgrund der Aktivität zellulärer Katalasen und Peroxidasen liegt die H2O2-Konzentration im E. coli-Zytoplasma im niedrigen nanomolaren Bereich40,41. Allerdings kann die Zugabe von exogenem H2O2 die zwischenzeitliche intrazelluläre Konzentration auf den mikromolaren Bereich erhöhen42. Daher wurde die Wirkung mikromolarer H2O2-Konzentrationen auf die durch Komplex I vermittelte NADH-Oxidation zunächst mit dem Protein in Membranen gemessen. Zytoplasmatische Membranen des Stammes BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis wurden durch Differentialzentrifugation erhalten. Aufgrund des Fehlens der alternativen NADH-Dehydrogenase (ndh) und der Störung des chromosomalen Nuo-Operons spiegeln alle von NADH abgeleiteten Aktivitäten der Membranen dieses Stamms ausschließlich Aktivitäten des auf dem Plasmid kodierten Wildtyp-Komplexes I wider.

Die NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität von Komplex I wird durch das an NuoF gebundene FMN katalysiert und beinhaltet nicht die Beteiligung von Fe/S-Clustern. Darüber hinaus ist diese Aktivität nicht mit der Protonentranslokation gekoppelt. Es stellte sich heraus, dass mikromolare H2O2-Konzentrationen keinen Einfluss auf diese Aktivität hatten. Nur millimolare Konzentrationen hatten einen signifikanten Einfluss auf die NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität (Abb. 1A). Die Titration mit bis zu 20 mM H2O2 führte zu einer 55 %igen Hemmung der Aktivität mit einem scheinbaren IC50 von 14,4 mM.

Hemmung von Komplex I durch H2O2. (A) NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität von Membranen aus Stamm BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis. 100 % Aktivität entsprechen 1,4 U mg−1. (B) NADH-Oxidase-Aktivität von Membranen aus Stamm BW25113Δndh nuo:nptII_FRT/pBADnuoHis. 100 % Aktivität entsprechen 0,27 U mg−1. (C) NADH:Decyl-Ubichinon-Oxidoreduktase-Aktivität des isolierten Komplexes I. 100 % Aktivität entsprechen 21,9 U mg−1. Die roten Linien durch die Datenpunkte dienen nur als Orientierung. Jeder Datenpunkt ist der Durchschnitt von drei technischen Replikaten von zwei biologischen Proben. Die Balken stellen das SEM an jedem Datenpunkt dar.

Um die Wirkung von H2O2 auf die physiologische Aktivität von Komplex I, einschließlich des Elektronentransfers über die Fe/S-Cluster zu Q, zu untersuchen, wurde sein Einfluss auf die NADH-Oxidase-Aktivität bestimmt (Abb. 1B). Wie bereits für die NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität beobachtet, hemmt H2O2 die NADH-Oxidase-Aktivität nur im millimolaren Bereich. Die Titration mit bis zu 20 mM H2O2 führte zu einer etwa 55 %igen Hemmung der Aktivität mit einem scheinbaren IC50 von 13,5 mM. Die Ähnlichkeit beider Hemmkurven lässt auf eine unspezifische Wirkung von H2O2 auf Komplex I in der Membran schließen.

Um festzustellen, ob die Hemmung reversibel ist, wurden ein unbehandeltes Aliquot der Membranen und ein mit 20 mM H2O2 behandeltes Aliquot dreimal zentrifugiert und jeweils in Puffer A ohne H2O2 resuspendiert. Die NADH/Ferricyanid- und NADH-Oxidase-Aktivität der behandelten Probe betrug in beiden Fällen 50 ± 5 % derjenigen der unbehandelten Probe. Dies legt nahe, dass die Hemmung durch H2O2 irreversibel ist.

Um die Wirkung von H2O2 auf Komplex I gezielt zu untersuchen, wurde das Protein in Gegenwart des Detergens LMNG isoliert (siehe ergänzende Abbildung S1) und die Hemmung der NADH: Decyl-Q-Oxidoreduktase-Aktivität des Präparats durch H2O2 gemessen. Im Bereich bis 1,25 mM H2O2 war kein Einfluss auf die Komplex-I-Aktivität erkennbar (Abb. 1C). Eine Zugabe von 20 mM H2O2 führte zu einer Hemmung der Aktivität um 65 %. Zusammenfassend zeigen unsere Experimente, dass H2O2 bei unter physiologischen Bedingungen beobachteten Konzentrationen keinen Einfluss auf die Aktivität von Komplex I hat.

Um festzustellen, ob H2O2 dennoch in der Lage ist, die Fe/S-Cluster des Komplexes zu schädigen, wurde ein Präparat in Aliquots aufgeteilt und die Proben entweder mit Puffer oder mit einem gleichen Volumen H2O2 in verschiedenen Konzentrationen behandelt. Die Proben wurden mit einem 2000-fachen molaren Überschuss an NADH reduziert, eine Minute lang bei Umgebungstemperatur mit H2O2 inkubiert und dann in einer Kältemittellösung bei 150 K eingefroren. EPR-Spektren wurden bei 40 K und 2 mW Mikrowellenleistung aufgenommen, um die beiden Zweikerne nachzuweisen Fe/S-Cluster von Komplex I, N1a und N1b. Darüber hinaus wurden Spektren bei 13 K und 5 mW aufgenommen, um die vierkernigen Cluster N2, N3 und N4 nachzuweisen. Die anderen Fe/S-Cluster des Komplexes sind durch EPR43 nicht nachweisbar. Als Referenz diente die nur mit Puffer gelieferte Probe. Proben, die zuerst mit H2O2 behandelt und dann mit NADH reduziert wurden, führten zu ähnlichen EPR-Spektren. Eine 30-minütige Inkubation der Proben mit H2O2 vor oder nach der Reduktion durch NADH führte zu keinen spektralen Veränderungen.

Das bei 40 K und 2 mW Mikrowellenleistung erhaltene Spektrum der Referenzprobe zeigte das Vorhandensein der zweikernigen Cluster N1a (gx,y,z = 1,92, 1,94 und 2,00) und N1b (g//,⊥ = 2,03 und 1,94; Abb. 2a). Die Signale der vierkernigen Fe/S-Cluster N2 (g//,⊥ = 1,91 und 2,05), N3 (gx,y,z = 1,88, 1,92 und 2,04) und N4 (gx,y,z = 1,89, 1,93). , und 2.09) waren in dem bei 13 K und 5 mW Mikrowellenleistung aufgezeichneten Spektrum zusätzlich zu den Signalen der zweikernigen Cluster vorhanden (Abb. 2d).

EPR-Spektren des isolierten E. coli-Komplexes I bei verschiedenen H2O2-Konzentrationen. Die Spektren wurden von einer unbehandelten Probe (a,d) und einem Aliquot aufgenommen, das mit 100 µM (b,e) und 1 mM (c,f) H2O2 inkubiert wurde. Die Spektren wurden bei 40 K und 2 mW Mikrowellenleistung (linke Reihe, a–c) aufgenommen, um die zweikernigen Fe/S-Cluster nachzuweisen, und bei 13 K und 5 mW Leistung (rechte Reihe, d–f), um zusätzlich die vierkernigen Fe/S-Cluster nachzuweisen. S-Cluster. Einzelne Signale werden gemäß59 den unterschiedlichen Fe/S-Clustern zugeordnet. Der zentrale g-Bereich um g = 1,94 ist in (f) aufgrund des fehlenden g⊥ von N1b bei 1,94 gestört.

EPR-Spektren der Proben, die mit bis zu 100 µM H2O2 inkubiert wurden, zeigten keine signifikante spektrale Veränderung (Abb. 2b, e). Die mit 1 mM H2O2 behandelte Probe zeigte jedoch deutlich einen drastischen und spezifischen Verlust des Clusters N1b (Abb. 2c, f). Die Differenz des Spektrums der unbehandelten Probe bei 40 K minus dem der mit 1 mM H2O2 behandelten Probe zeigt deutlich die Signale des Clusters N1b (siehe ergänzende Abbildung S2). Somit hat sich der Anteil von N1a nicht verändert, da dessen Signal sonst auch im Differenzspektrum nachweisbar wäre. Eine vollständige Oxidation von N1b lässt sich aus dem Differenzspektrum jedoch nicht ableiten. Der Verlust des Clusters N1b ist auch in den bei 13 K und 5 mW Mikrowellenleistung aufgezeichneten Spektren zu erkennen (Abb. 2c, f). Hier ist in den bei 13 K aufgenommenen Spektren noch eine Restmenge N1b nachweisbar (Abb. 2f), was darauf hindeutet, dass der Cluster nicht vollständig beschädigt ist. Die doppelte Integration des N1b-Signals bei g = 2,03, die keine Überlappung mit anderen Signalen aufweist, zeigte, dass 68 % von N1b durch 1 mM H2O2 beschädigt werden. Allerdings veränderte sich die Menge des zweikernigen Clusters N1a und der vierkernigen Cluster N2, N3 und N4 auch in Gegenwart von 50 mM H2O2 nicht. Somit führt 1 mM H2O2 zu einer spezifischen Schädigung des zweikernigen Clusters N1b, während selbst höchste H2O2-Konzentrationen in unseren Untersuchungen keinen Einfluss auf die anderen Fe/S-Cluster des Komplexes I haben.

Um zu unterscheiden, ob Cluster N1b durch H2O2 lediglich oxidiert oder „überoxidiert“ wird, wurde Komplex I 5 Minuten lang mit 1 mM H2O2 inkubiert. Anschließend wurde das überschüssige H2O2 durch wiederholtes Aufkonzentrieren und Verdünnen entfernt. Die Probe wurde mit NADH reduziert und das EPR-Spektrum zeigt das Fehlen des Clusters N1b (siehe ergänzende Abbildung S3). Somit wird N1b durch H2O2 irreversibel geschädigt und nicht einfach oxidiert.

Die Struktur des Komplexes aus verschiedenen Spezies zeigt, dass die Fe/S-Zentren nicht dem Lösungsmittel ausgesetzt sind. Um herauszufinden, warum N1b dennoch von H2O2 angegriffen werden kann, haben wir uns die Kryo-EM-Struktur des peripheren Arms des E. coli-Komplexes, der alle Fe/S-Cluster enthält, genauer angesehen44. N1b wird von vier Cysteinresten einer typischen [2Fe–2S]-Ferredoxin-Faltung am N-terminalen Teil von NuoG koordiniert (Abb. 3). Diese Domäne verbindet NuoE und NuoF mit NuoG. Cluster N1b ist etwa 5 Å von der Oberfläche von NuoG entfernt, jedoch ohne direkten Lösungsmittelzugang (Abb. 3). Wir haben das Programm CAVER verwendet, um mögliche Lösungsmittelkanäle zu identifizieren, die von der Proteinoberfläche zum Cluster führen könnten. Ein Kanal mit einem Durchmesser von 2,28 Å führt vom Lösungsmittel zum Cluster (Abb. 3A). Der Kanal wird von den Resten Gly45G, Arg46G und Met67G flankiert (der hochgestellte Index bezieht sich auf den Namen der Untereinheit des E. coli-Komplexes I). Der Mitochondrienkomplex I enthält mehrere akzessorische Untereinheiten, deren Anzahl vom jeweiligen Organismus abhängt. Allerdings schirmt keine dieser akzessorischen Untereinheiten Cluster N1b weiter gegenüber dem Lösungsmittel ab. Exemplarisch ist die Umgebung des Clusters N1b des Komplexes I aus Schafmitochondrien36 in Abb. 3B dargestellt. Im Mitochondrienkomplex I liegt N1b etwa 8,2 Å unter der Proteinoberfläche. Hier hat der Kanal einen etwas kleineren Durchmesser von 2,26 Å und erstreckt sich U-förmig über eine längere Strecke (Abb. 3B). Dies ist auf das Vorhandensein von Leu225 aus der Untereinheit NDUFV1, dem Homologen von E. coli NuoF, und Arg53 aus NDUFS1, dem Homologen von E. coli NuoG, zurückzuführen, die beide den direkten Weg zum Cluster blockieren. Im Schafkomplex I wird der Weg weiter durch die Reste Gly50, Arg53, Ala67 und Ala70 von NDUFS1 und Tyr118 von der Untereinheit NDUFS4 gesteuert, einer akzessorischen Untereinheit, die ein strukturelles Homolog einer Extradomäne von NuoG44 ist. Die Lösungsmittelkanäle sind in beiden Organismen ausreichend groß, um den Durchgang von H2O2 zum Cluster zu ermöglichen. Einige der Auskleidungsatome sind hydrophob und behindern den schnellen Durchgang, ohne ihn jedoch zu blockieren. Somit würde eine Zugabe von H2O2 vermutlich auch zu einer Schädigung von N1b im Mitochondrienkomplex I führen.

Oberflächenzugänglichkeit für H2O2 der Cluster N1a und N1b in E. coli und O. aries. Oberflächenkanäle wurden mit CAVER 3.0.3 auf den PDB-IDs 7AWT (E. coli) und 7ZD6 (O. aries) untersucht. Abstände der Auskleidungsatome zu den Kanalzentren an Engstellen sind angegeben und zusätzlich mit Strichen gekennzeichnet. (A,B) Lösungsmittelkanäle, die zu N1b in E. coli (A) und O. aries (B) führen. Die bereitgestellten Durchmesser sind schmal, aber vermutlich ausreichend, um den Durchgang von H2O2 zu N1b zu ermöglichen, mit 2,28 Å in E. coli und 2,26 Å in O. aries. Beachten Sie, dass im O. aries-Komplex I ein direkter Weg zum Cluster durch R53 von NDUFS1 blockiert wird. Der lineare Abstand von N1b zur lösungsmittelzugänglichen Oberfläche beträgt 4,9 Å (E. coli) bzw. 8,2 Å (O. aries) (nicht angegeben). (C,D) Die H2O2-Zugänglichkeit von N1a ist bei Kanaldurchmessern von 1,98 Å (E. coli) und 1,90 Å (O. aries) eingeschränkt. Die unpolaren Atome an den Verengungen stoßen polare Moleküle effizient ab. Der minimale Abstand der N1a-Eisenatome zur Oberfläche beträgt 7,3 Å (E. coli) bzw. 9,3 Å (O. aries) (nicht angegeben).

Es wurde bereits berichtet, dass H2O2 keinen Einfluss auf die Aktivität des E. coli-Komplexes I hat42. Es wurden jedoch keine Daten angezeigt und es wurde lediglich erwähnt, dass 5 mM H2O2 die Aktivität nicht verringern. Aus diesen Daten wurde geschlossen, dass H2O2 die Fe/S-Cluster des Komplexes I42 nicht oxidiert. Hier zeigen wir, dass die Inkubation von E. coli-Membranen mit 5 mM H2O2 zu einer kleinen, aber signifikanten Hemmung der NADH-Oxidase-Aktivität führt, wenn Komplex I überproduziert wird. Die halbmaximale Hemmung wird bei 13,5 mM H2O2 erreicht (Abb. 1B). Die Hemmung der NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität zeigte einen ähnlichen Aktivitätsverlauf mit einem IC50 von 14,4 mM H2O2 (Abb. 1A). Die Inkubation von freiem FMN und NADH mit 20 mM H2O2 führt jedoch nicht zu deren chemischer Modifikation (siehe ergänzende Abbildung S4). Daraus schließen wir, dass die Abnahme der NADH-Oxidase- und NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivitäten bei hohen H2O2-Konzentrationen (Abb. 1A, B) höchstwahrscheinlich auf eine unspezifische Proteinoxidation zurückzuführen ist45.

Im Gegensatz zu der Annahme, dass H2O2 keinen Einfluss auf den Fe/S-Cluster des Komplexes42 hat, zeigen wir jedoch experimentell durch EPR-Spektroskopie, dass die Zugabe von 1 mM H2O2 zum oxidativen Abbau des zweikernigen Clusters N1b auf der Untereinheit NuoG führt (Abb . 2). Berechnungen der intramolekularen Elektronentransferraten ergaben, dass der Elektronentransfer von Cluster N3 zu N4 über Cluster N1b leicht durch einen direkten Elektronentransfer von Cluster N3 zu N4 umgangen werden kann, die sich beide auf NuoG befinden (Abb. 4)46,47. In diesem Fall überträgt das reduzierte Flavin seine Elektronen nacheinander auf den Cluster N3, wie im unbehandelten Komplex. Hier erfahren die Elektronen einen sequenziellen vorübergehenden Stopp, bevor sie an den Clustern N4 und N547 erscheinen. Der Rand-zu-Rand-Abstand zwischen N3 und N4 beträgt 14,9 Å, was theoretisch zu einer insgesamt zehnfach verringerten intramolekularen Elektronentransferrate führt46,47. Dadurch wird sich die gesamte Elektronentransferrate von NADH zu Q nicht ändern, da die Q-Reduktion und -Freisetzung viel langsamer ist als der intramolekulare Elektronentransfer entlang der Fe/S-Cluster43. Kürzlich haben wir eine Komplex-I-Variante ohne Cluster N1b generiert, indem wir das E. coli-Eisen-Schwefel-Cluster-Trägerprotein BolA48 gelöscht haben. Das Fehlen des Clusters N1b führte zur Bildung eines aktiven Komplexes. Wichtig ist, dass der Verlust von N1b keinen Einfluss auf die NADH-Oxidaseaktivität der mutierten Membranen hatte, was bedeutet, dass der Mangel an N1b die Gesamtelektronentransferrate von NADH auf Q48 nicht veränderte.

Schema, das die Anordnung der Fe/S-Cluster im Elektroneneingangsmodul des E. coli-Komplexes I zeigt. Dargestellt sind die relativen Positionen der Cluster N1a (NuoE), N3 (NuoF) und N1b, N4 und N5 (alle NuoG). Die Pfeile zeigten mögliche Wege des Elektronentransfers an. Die Kantenabstände zwischen den Clustern in Å sind auf den jeweiligen Pfeilen angegeben. Der Mangel an N1b kann durch direkten Elektronentransfer von N3 auf N4 umgangen werden (rot; Nomenklatur nach59).

Die oxidative Schädigung von N1b durch H2O2 war unerwartet, da die Fe/S-Cluster von Komplex I gut im Protein verborgen sind. Der mit dem Programm CAVER identifizierte kurze Kanal ebnet jedoch den Weg für H2O2 von der Proteinoberfläche zum Cluster N1b im bakteriellen und mitochondrialen Komplex I (Abb. 3). Betrachtet man die Gesamtstruktur des Komplexes, scheint es, dass Cluster N1a auf NuoE dem wässrigen Medium am stärksten ausgesetzt ist (Abb. 3). Andererseits ist die Proteinumgebung von N1a hydrophober als die der anderen Cluster. Tatsächlich identifizierte CAVER einen Kanal mit einem Durchmesser von 1,98 Å in E. coli bzw. 1,9 Å im Schafkomplex I (Abb. 3C, D), der von der Proteinoberfläche direkt zu N1a führt. Bemerkenswert ist jedoch, dass dieser Kanal an den jeweiligen Engstellen mit unpolaren Atomen ausgekleidet ist. Höchstwahrscheinlich verhindert diese hydrophobe Oberfläche des Kanals, dass H2O2 auch den Cluster N1a schädigt.

Zusammengenommen zeigen unsere Daten deutlich, dass physiologische H2O2-Konzentrationen die Fe/S-Cluster des Atmungskomplexes I nicht schädigen. Darüber hinaus schädigen erhöhte Konzentrationen speziell den Cluster N1b. Eine N1b-Schädigung hat jedoch keinen Einfluss auf die Aktivität von Komplex I, da dieser Cluster während des intramolekularen Elektronentransfers umgangen werden kann, wodurch die physiologische Aktivität des Komplexes erhalten bleibt.

Als Wirt für die Überproduktion des Komplexes I48 wurde ein Derivat des E. coli-Stammes BW2511349 verwendet, dem das Gen ndh chromosomal fehlt. Das chromosomale Nuo-Operon dieses Stammes wurde durch eine Resistenzpatrone (nptII) ersetzt. Der Wirtsstamm wurde mit dem Plasmid pBADnuoHis transformiert, das das gesamte Nuo-Operon50 kodiert. Die Expression des Nuo-Operons wurde durch die Zugabe von 0,2 % (Gew./Vol.) l-Arabinose induziert. Zur Proteinvorbereitung wurden die Zellen bei 37 °C in einem reichhaltigen Autoinduktionsmedium mit 34 µg/ml Chloramphenicol unter Rühren bei 180 U/min gezüchtet51. Gemäß dem Versuchsaufbau beruhen alle NADH-induzierten Aktivitäten der Membranen des transformierten Stamms auf der katalytischen Aktivität des überproduzierten Komplexes I, der vom Plasmid kodiert wird.

Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, in 50 mM MES/NaOH, 50 mM NaCl, pH 6,0 (Puffer A), enthaltend 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und einige Körner DNAseI, suspendiert und durch drei Passagen durch einen HPL-6 (Maximator, 1000–1500 bar)51. Zytoplasmamembranen wurden durch Differentialzentrifugation51 erhalten und in einem gleichen Volumen (1:1, w/v) Puffer A mit 5 mM MgCl2 und 0,1 mM PMSF suspendiert.

Der Komplex wurde wie beschrieben52 hergestellt. Kurz gesagt, Membranproteine ​​wurden mit 2 % (w/v) Laurylmaltoseneopentylglykol (LMNG; Endkonzentration) extrahiert, der geklärte Extrakt wurde auf 20 mM Imidazol eingestellt und auf eine äquilibrierte 35 ml ProBond Ni2+-IDA-Säule (Invitrogen) aufgetragen in Puffer A mit 5 mM MgCl2, 10 % (v/v) Glycerin, 0,005 % (w/v) LMNG und 20 mM Imidazol bei pH 6,8. Gebundene Proteine ​​wurden mit dem gleichen Puffer, der 308 mM Imidazol enthielt, eluiert. Fraktionen mit NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität wurden gepoolt, durch Ultrafiltration in 100 kDa MWCO Amicon Ultra-15-Zentrifugalfiltergeräten (Millipore) konzentriert und unter Verwendung einer Superose 6-Größenausschlusschromatographiesäule (300 ml, GE Healthcare), äquilibriert in Puffer A mit 5, poliert mM MgCl2, 10 % (v/v) Glycerin und 0,005 % (w/v) LMNG. Die Fraktionen mit der höchsten NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität wurden für weitere Studien verwendet.

Aktivitätstests wurden bei 30 °C durchgeführt. Die NADH-Oxidaseaktivität von Zytoplasmamembranen wurde mit einer Sauerstoffelektrode vom Clarke-Typ (DW1; Hansatech) wie beschrieben51 bestimmt. Die Elektrode wurde durch Zugabe einiger Körner Natriumdithionit zu luftgesättigtem Puffer kalibriert51. Die NADH/Ferricyanid-Oxidoreduktase-Aktivität wurde als Abnahme der Ferricyanid-Absorption bei 410 nm mit einem Diodenarray-Spektrometer (QS-Küvette, d = 1 cm, Hellma; TIDAS II, J&M Aalen) unter Verwendung eines ε von 1 mM−1 cm− bestimmt 153. Der Assay wurde in Puffer A durchgeführt, der 1 mM Ferricyanid und 0,2 mM NADH enthielt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe des Proteins gestartet und die Geschwindigkeit der enzymatischen Reaktion wurde um den Wert der nicht-enzymatischen Reaktion korrigiert. Die NADH:Decyl-Q-Oxidoreduktase-Aktivität wurde als Abnahme der NADH-Konzentration bei 340 nm unter Verwendung eines ε von 6,3 mM−1 cm−1 (QS-Küvette, d = 1 cm, Hellma; TIDAS II, J&M Aalen) gemessen. Der gereinigte Komplex I wurde im Verhältnis 1:1 (w/w) mit polaren E. coli-Lipiden (10 mg mL−1; Avanti) gemischt und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der Assay enthielt 60 µM Decyl-Q, 2 µg Komplex I und einen zehnfachen molaren Überschuss (5 µg) E. coli-Cytochrom-bo3-Oxidase in Puffer A mit 5 mM MgCl2, 10 % (v/v) Glycerin und 0,005 % (w/v). v) LMNG. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 150 µM NADH46 gestartet. Unmittelbar vor Beginn der Reaktion wurden den Tests unterschiedliche Konzentrationen H2O2 (30 %, v/v; Chemsolute) zugesetzt.

Um die Reversibilität der H2O2-Hemmung zu bestimmen, wurden die Membranen 5 Minuten lang mit 20 mM H2O2 inkubiert. Aliquote behandelter und unbehandelter Membranen wurden zentrifugiert (178.000 g, 4 °C, 60 min, Rotor 60Ti, Sorvall wX + Ultra-Zentrifuge, Thermo Scientific) und im zehnfachen Volumen Puffer A mit 5 mM MgCl2 und 0,1 mM resuspendiert PMSF. Dieses Verfahren wurde zweimal wiederholt und die NADH/Ferricyanid- und NADH-Oxidase-Aktivität beider Proben bestimmt.

EPR-Messungen wurden mit einem EMX 6/1-Spektrometer (Bruker) durchgeführt, das im X-Band arbeitete. Die Probentemperatur wurde mit einem ESR-9-Heliumflusskryostat (Oxford Instruments) gesteuert. Die Spektren wurden bei 40 K und 2 mW Mikrowellenleistung und bei 13 K und 5 mW Mikrowellenleistung von 300 bis 380 mT aufgenommen. Weitere EPR-Bedingungen waren: Mikrowellenfrequenz 9,360 GHz; Modulationsamplitude, 0,6 mT; Zeitkonstante 0,164 s; Scanrate: 17,9 mT min−1. 300 µL Komplex I (2,5–3,5 mg mL−1) in Puffer A wurden mit einem 2000-fachen molaren Überschuss an NADH (10–14 mM) reduziert und bei 150 K in 2-Methylbutan/Methylcyclohexan (1:5; v: v).

Um festzustellen, ob H2O2 den Cluster N1b oxidiert oder schädigt, wurde Komplex I 5 Minuten lang mit 1 mM H2O2 inkubiert. Das überschüssige H2O2 wurde durch Konzentrieren der Probe durch Ultrafiltration (Amicon Ultra-15, MWCO: 100 kDa, Millipore; 3800 g, 4 °C, Rotor A-4-44, Zentrifuge 5804R, Eppendorf) und anschließende zehnfache Verdünnung in Puffer A entfernt mit 5 mM MgCl2, 10 % (v/v) Glycerin und 0,005 % (w/v) LMNG. Dieser Vorgang wurde zweimal wiederholt. Es wurde ein EPR-Spektrum der konzentrierten Probe, reduziert um einen 2000-fachen molaren Überschuss an NADH, aufgezeichnet.

Die Lösungsmittelzugänglichkeit der Fe/S-Cluster von E. coli und des Schafkomplexes I wurde mit dem PyMOL-Plugin CAVER (Version 3.0.3)54,55 bei minimalen Radien von 0,90–1,20 Å unter Verwendung des pdb-Modells 7AWT des peripheren Arms untersucht alle Cluster44 und das PDB-Modell 7ZD6 des Schafkomplexes I36.

Die Proteinkonzentration wurde nach der Biuret-Methode unter Verwendung von BSA als Standard56 bestimmt. Die Konzentration des gereinigten Komplexes I wurde durch UV/Vis-Spektroskopie (TIDAS II, J&M Aalen) unter Verwendung eines ε von 781 mM−1 cm−1 bestimmt, abgeleitet aus der Aminosäuresequenz57. SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) wurde mit einem 10 %igen Trenngel und einem 3,9 %igen Stapelgel58 durchgeführt. Eine mögliche Oxidation von FMN und NADH durch H2O2 wurde mittels LC-MS-Analyse untersucht. 1 mM FMN und 1 mM NADH (beide von Sigma Aldrich) in Puffer A wurden mit 20 mM H2O2 30 Minuten lang bei Umgebungstemperatur inkubiert und dann einer HPLC (ProntoSIL 120-3-C18; AQ plus; 1 ml, 150 × 3,0) unterzogen mm) bei einer Flussrate von 0,5 mL min−1 in 10 % Triethylammoniumacetat (100 mM) und 90 % Wasser. Nach 1 Minute wurde über 17 Minuten ein Gradient von 10 bis 90 % Acetonitril angelegt. Eluierende Proben wurden direkt mit API-MS (Dionex MSQ Plus) analysiert.

Die Daten, die die Ergebnisse dieses Artikels stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) durch die Fördermittel 278002225/RTG 2202 und SPP1927 gefördert; FR 1140/11-2 bis TF.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Institut für Biochemie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Albertstr. 21, 79104, Freiburg, Germany

Lisa Strotmann, Caroline Harter, Tatjana Gerasimova, Daniel Wohlwend & Thorsten Friedrich

Institut für Organische Chemie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Albertstr. 21, 79104, Freiburg, Germany

Kevin Ritter & Henning J. Jessen

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LS, CH und TG reinigten das Protein, LS führte die Aktivitätsmessungen durch und erfasste die Daten, TF zeichnete die EPR-Spektren auf, DW führte Berechnungen durch, KR und HJJ zeichneten die LC-MS-Daten auf, alle Autoren analysierten die Daten. TF hat das Manuskript mit Hilfe aller Autoren geschrieben, TF hat die Studie entworfen.

Korrespondenz mit Thorsten Friedrich.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Strotmann, L., Harter, C., Gerasimova, T. et al. H2O2 schädigt selektiv den zweikernigen Eisen-Schwefel-Cluster N1b des Atmungskomplexes I. Sci Rep 13, 7652 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5

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Eingegangen: 08. Februar 2023

Angenommen: 08. Mai 2023

Veröffentlicht: 11. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34821-5

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