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Aug 04, 2023

Coenzym-A-Bindungsstellen induzieren eine proximale Acylierung über Proteinfamilien hinweg

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 5029 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Lysin-Nɛ-Acylierungen wie Acetylierung oder Succinylierung sind posttranslationale Modifikationen, die die Proteinfunktion regulieren. In Mitochondrien erfolgt die Lysin-Acylierung überwiegend nichtenzymatisch und nur eine bestimmte Untergruppe des Proteoms wird acyliert. Coenzym A (CoA) kann über eine Thioesterbindung als Acylgruppenträger fungieren, aber was die Acylierung mitochondrialer Lysine steuert, ist noch wenig verstanden. Anhand veröffentlichter Datensätze haben wir hier herausgefunden, dass Proteine ​​mit einer CoA-Bindungsstelle eher acetyliert, succinyliert und glutaryliert werden. Mithilfe von Computermodellen zeigen wir, dass Lysinreste in der Nähe der CoA-Bindungstasche im Vergleich zu weiter entfernten Lysinresten stark acyliert sind. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Acyl-CoA-Bindung die Acylierung benachbarter Lysinreste verstärkt. Um diese Hypothese zu testen, inkubierten wir Enoyl-CoA-Hydratase Short Chain 1 (ECHS1), ein CoA-bindendes mitochondriales Protein, mit Succinyl-CoA und CoA. Mittels Massenspektrometrie stellten wir fest, dass Succinyl-CoA eine weit verbreitete Lysin-Succinylierung induzierte und dass CoA die ECHS1-Succinylierung kompetitiv hemmte. Die durch CoA induzierte Hemmung an einer bestimmten Lysinstelle korrelierte umgekehrt mit dem Abstand zwischen diesem Lysin und der CoA-Bindungstasche. Unsere Studie zeigte, dass CoA als kompetitiver Inhibitor der ECHS1-Succinylierung fungiert, indem es an die CoA-Bindungstasche bindet. Zusammengenommen lässt dies darauf schließen, dass die proximale Acylierung an CoA-Bindungsstellen ein primärer Mechanismus für die Lysin-Acylierung in den Mitochondrien ist.

Lysinacylierungen wie Acetylierung, Succinylierung oder Glutarylierung sind posttranslationale Modifikationen (PTM)1,2,3, die die Wirkung von Proteinen in allen Lebensbereichen und allen Zellkompartimenten hemmen4,5,6. In eukaryotischen Zellen verringert die Acylierung von Histonen die elektrostatische Affinität zwischen Histonen und DNA und ist im Allgemeinen mit einer Erhöhung der Genexpression verbunden7. Coenzym A (CoA) ist ein Metabolit, der in einer Vielzahl von Stoffwechselprozessen benötigt wird, einschließlich der Biosynthese von Fettsäuren und Ketonkörpern, dem Aminosäurestoffwechsel, der Fettsäureoxidation und der Regulierung der Genexpression8,9. In Eukaryoten fungieren CoA-Thioester wie Acetyl-CoA, Succinyl-CoA und Glutaryl-CoA als einzige zelluläre Acylgruppendonoren und reagieren mit Lysinresten über (1) enzymatischen Transfer, der durch Acetyltransferase-Enzyme wie p30010 vermittelt wird, 11 und (2) nicht-enzymatische Mechanismen, die durch hohe lokale Konzentrationen von Acyl-CoA-Spezies und einen hohen pH-Wert erleichtert werden5,12. Im Zytosol und Zellkern wird die Lysin-Acylierung hauptsächlich durch Acyltransferase-Enzyme wie p300 vorangetrieben, und Muster der unterschiedlichen Acylierung wurden auf die Spezifität und Verteilung dieser Enzyme zurückgeführt. In der mitochondrialen Matrix wurde jedoch kein universelles Acyltransferase-Enzym identifiziert, und es wird angenommen, dass die mitochondriale Acylierung größtenteils nicht enzymatisch erfolgt13,14. Die Verteilung der acylierten Lysine in den Mitochondrien ist jedoch nicht stochastisch, da zwischen den Standorten Unterschiede in der Acylierung um Größenordnungen festgestellt werden14. Warum einige mitochondriale Lysinreste anfälliger für Acylierungen sind als andere, bleibt eine wichtige unbeantwortete Frage.

Der mitochondriale Stoffwechsel hängt von mehreren Acyl-CoA-Spezies ab, die als wichtige Zwischenprodukte in kritischen Stoffwechselwegen dienen, wie dem TCA-Zyklus (Acetyl-CoA, Succinyl-CoA), der Fettsäureoxidation (Acetyl-CoA, Propanoyl-CoA, längerkettiges Acyl-CoA). CoAs), Ketonkörperkatabolismus (3-Hydroxymethylglutaryl-CoA, Acetoacetyl-CoA) und Aminosäurekatabolismus (Succinyl-CoA, Glutaryl-CoA, HMG-CoA). Diese reaktiven Acyl-CoA-Spezies dienen als Acyldonor für die nichtenzymatische Acylierung mitochondrialer Proteine15. Für eine begrenzte Untergruppe von Lysin-Acylierungen wurden regulatorische Rollen identifiziert, die mit dem Großteil der Lysin-Acylierungen koexistieren, die nicht regulierend und niedrigstöchiometrisch sind13,14. Wichtig ist, dass viele Lysinreste des mitochondrialen Proteins nicht acyliert sind und nachfolgende Messungen der Acetylierungsstöchiometrie in der Mausleber einen extrem breiten Bereich der Acetylierung zeigen14. Ziel der vorliegenden Studie ist es, die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die die Acylierung spezifischer Lysinreste in den Mitochondrien steuern.

Während keine universellen mitochondrialen Acyltransferasen identifiziert wurden, sind die Deacylasen, die Acylgruppen von Lysinresten entfernen, gut charakterisiert. In den Mitochondrien wurden die menschlichen Sirtuine SIRT3, SIRT4 und SIRT5 als die wichtigsten Lysin-Deacylasen identifiziert. Sirtuine sind eine Familie konservierter Proteindeacylasen, die NAD als Cosubstrat verwenden16,17. SIRT3 reguliert die Proteinacetylierung18,19 und SIRT5 reguliert saure Acylmodifikationen wie Succinylierung, Malonylierung und Glutarylierung3,20,21,22. Über SIRT4 ist hinsichtlich seiner enzymatischen Aktivität weniger bekannt; Es wirkt jedoch auf verzweigtkettige Acyl-Lysin-Reste23. Massenspektrometriestudien haben die Landschaft mehrerer Acylierungsmarkierungen in mehreren Arten, Geweben und subzellulären Kompartimenten kartiert. Proteomische Untersuchungen zur Acylierung mitochondrialer Proteine ​​unter Verwendung von Knockout-Mausstämmen gegen die mitochondrialen Sirtuine SIRT3 und SIRT5 identifizierten die Stellen der Proteinacetylierung, Succinylierung und Glutarylierung. Da mitochondriale Sirtuin-Knockout-Mäuse phänotypisch normal sind, wurden sie verwendet, um eine hochwertige proteomische Karte acylierter Lysine in Zelllinien und Geweben zu erstellen1,2,24. Trotz der wichtigen Rolle, die die Histonacetylierung für die Genregulation im Zellkern spielt, zeigten acylomische Studien, dass der Großteil der zellulären Acylierung innerhalb der Mitochondrien erfolgt25,26,27, höchstwahrscheinlich durch nichtenzymatischen Transfer von Acylgruppen von CoA-Thioestern. Die CoA-Konzentrationen können in den Mitochondrien 2,2 bis über 5 mM erreichen, und die zytosolischen Konzentrationen werden auf 0,02–0,14 mM geschätzt28.

Interessanterweise sind Stoffwechselwege (z. B. TCA-Zyklus, Fettsäureoxidation, Ketonkörperkatabolismus, Aminosäurekatabolismus und Ketonkörpersynthese), die Enzyme enthalten, die direkt mit reaktiven CoA-Spezies interagieren, an Acylierungen angereichert5,29,30. Häufig treten experimentell validierte Stellen an Enzymen auf, die eine oder mehrere Acyl-CoA-Spezies binden, wobei eine hemmende Acylierung in oder in der Nähe der CoA-Bindungsstelle gefunden wird2,3,30,31. Ob die CoA-Bindung und die Enzym-Lysin-Acylierung ursächlich miteinander verbunden sind, wurde jedoch nicht berichtet. Darüber hinaus zeigte eine aktuelle Studie einen leichten Anstieg der Acetylierung in der Nähe von Nukleotidbindungsstellen und legte nahe, dass Enzyme mit ADP-bindenden Rossmann-Faltungsmotiven Acyl-CoAs32 binden könnten. Die Autoren beobachteten auch einen Anstieg der Malonylierung von Lysin durch Malonyl-CoA in der Nähe der Nukleotidbindungsstelle der Glutamatdehydrogenase32. Diese Studien legen nahe, dass Interaktionen mit CoA-Spezies speziell die Acylierung von CoA-bindenden Proteinen (CoABPs) verstärken.

Hier untersuchten wir die Faktoren, die die Lysin-Acylierung in den Mitochondrien steuern. Mithilfe rechnerischer Analysen veröffentlichter acylomischer Datensätze haben wir gezeigt, dass CoABPs in den Mitochondrien etwa dreimal häufiger acyliert werden als Nicht-CoABPs. Darüber hinaus haben wir mögliche CoA-Strukturkonformationen modelliert und festgestellt, dass in CoABPs Lysinreste in der Nähe der CoA-Bindungstasche eher acyliert werden als diejenigen, die weit von der CoA-Bindungstasche entfernt sind. Wir stellten die Hypothese auf, dass die Acyl-CoA-Bindung die Acylierung benachbarter Lysinreste verstärken könnte (Abb. 1) und testeten diese Hypothese an Enoyl-CoA-Hydratase Short Chain 1 (ECHS1), einem mitochondrialen Protein mit einer CoA-Bindungstasche. Die Inkubation mit Succinyl-CoA induzierte eine weit verbreitete Succinylierung der meisten ECHS1-Lysinreste. Wichtig ist, dass die Succinylierung durch gleichzeitige Inkubation mit CoA kompetitiv gehemmt wurde und die CoA-Hemmung an einer bestimmten Lysinstelle umgekehrt mit dem Abstand zwischen diesem Lysinrest und der CoA-Bindungstasche korrelierte. Dieser Befund legt nahe, dass die proximale Acylierung an Protein-CoA-Bindungsstellen ein primärer Mechanismus für die Lysin-Acylierung in ECHS1 und wahrscheinlich allgemeiner in den Mitochondrien ist.

Computermodellierung und massenspektrometrische Analyse enthüllten den Mechanismus der Lysin-Acylierung am CoA-bindenden Protein in den Mitochondrien. (a) Schematische Darstellung der experimentellen Ansätze in dieser Studie und der getesteten Hypothesen. Statistische Analysen proteomweiter MS-Acylierungsdatensätze unter Verwendung von Datenbankannotationsdaten und anschließende Strukturmodellierung acylierter Proteine ​​ergaben einen vorgeschlagenen Mechanismus für die Hyperacylierung von CoA-bindenden Proteinen. Dieser Mechanismus wurde durch In-vitro-MS-Analyse eines berichteten acylierten Proteins validiert.

CoA-Thioester sind die wichtigsten Acylgruppenspender in Säugetierzellen9,33 (Abb. 2a). Wir stellten die Hypothese auf, dass CoABPs an Acylierungsmarkierungen angereichert sein sollten, insbesondere in den Mitochondrien, wo CoA-Thioester in hohen Konzentrationen vorhanden sind (Abb. 1). Um festzustellen, ob die CoA-Bindung die Lysin-Acylierung induziert, haben wir den Anteil der in CoABPs identifizierten acylierten Lysine unter allen acylierten Lysinen berechnet. Eine Liste von CoABPs wurde aus Uniprot-Annotationsdaten erstellt (Ergänzungstabelle 1). Im annotierten Mausproteom gehören 2,7 % der Lysinreste zu CoABPs (14.759 von 547.206). Im Gegensatz dazu stammten in einem Datensatz zur Acetylierung der gesamten Mausleber34 26,5 % der acylierten Reste aus Maus-CoABPs (512 von 1.934) (Abb. 2b). Die Berechnung eines relativen Odds Ratio (OR) ergab, dass Lysine auf CoABPs 12,99-mal häufiger acetyliert wurden als Lysine auf Nicht-CoABPs (OR = 12,99, p = 3,68E−297).

Die Lysin-Acylierung ist bei CoA-bindenden Proteinen deutlich überrepräsentiert. (a) Diagramm der Acetylierungs-, Succinylierungs- und Glutarylierungsmodifikationen an Protein-Lysinresten. (b) Tabelle, die die Anreicherung von acetylierten Lysinen an CoA-bindenden Proteinen zeigt, die in einem Ganzzell-Mausleber-Acetylom-Datensatz analysiert wurden. Diese Anreicherung ist auch vorhanden, wenn der Datensatz in nicht-mitochondriale und mitochondriale Lysine unterteilt wurde. Die Signifikanz wurde mithilfe des exakten Fisher-Tests berechnet. (c) Tabelle, die die Anreicherung von acetylierten, succinylierten und glutarylierten Lysinen an CoA-bindenden Proteinen unter Verwendung von mitochondrialen Mausleber-Datensätzen zeigt. Für (b) und (c) wurden statistische Signifikanzen mithilfe des exakten Fisher-Tests berechnet.

Da der Großteil der zellulären Acylierung in den Mitochondrien stattfindet25,27, verglichen wir Lysine, die aus mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Proteinen stammen (Abb. 2b). In CoABPs annotierte Lysine machten 14,7 % bzw. 2,1 % aller Lysine in mitochondrialen und nicht-mitochondrialen Proteinen aus. Im oben genannten gesamten Mausleberdatensatz gehörten 39,0 % (424 von 1088) der mitochondrialen acetylierten Lysine und 10,4 % (88 von 846) der nicht-mitochondrialen Lysine zu CoABPs (Abb. 2b). Es war 3,72-mal wahrscheinlicher, dass Lysine auf CoABP in den Mitochondrien acetyliert wurden als Nicht-CoABP-Lysine (OR = 3,72, p = 6,61E−81) und außerhalb der Mitochondrien 5,34-mal wahrscheinlicher (OR = 5,34, p = 1,96E). −33) (Abb. 2b). Wir beobachteten eine ähnliche Anreicherung in einem Datensatz zur Acetylierung ganzer Zellen in menschlichen Hela-Zellen, wenn auch auf einem niedrigeren Niveau35. In Hela-Zellen war die Wahrscheinlichkeit, dass Lysine auf CoABPs acetyliert wurden, um 1,92 höher als bei Nicht-CoABP-Lysinen (OR = 1,92, p = 3,61E−61, ergänzende Abbildung S1).

Die meisten zellulären Acylierungsstellen befinden sich in den Mitochondrien, und wir haben den Rest unserer Untersuchung auf mitochondriale Proteine ​​konzentriert und dabei acylome Datensätze aus Mitochondrienextrakten verwendet. Mit dem gleichen Ansatz haben wir aus drei separaten acylomischen Datensätzen festgestellt, ob andere Arten der Acylierung in mitochondrialen CoABPs angereichert waren. Mitochondriale Lysin-Acylierungen, einschließlich Acetylierung1, Succinylierung30 und Glutarylierung3 (Abb. 2a), wurden in Gewebeproben von Knockout-Mäusen kartiert, denen die entsprechenden Sirtuin-Deacylasen fehlen, die diese Modifikationen entfernen. Unter den mitochondrialen Proteinen machten Lysinreste in CoABPs 10,1 % aller Lysine aus (2513 von 24.973). Im Gegensatz dazu machten acetylierte Lysine in CoABPs 29,0 % aller acetylierten Lysine aus (519 von 1788, Abb. 2c). In ähnlicher Weise waren in mitochondrialen Leberproben von Mäusen succinylierte und glutarylierte Lysine in CoABPs vertreten, 34,5 % (280 von 812) bzw. 37,2 % (204 von 549) aller succinylierten bzw. glutarylierten Proteine. (Abb. 2c). In diesen mitochondrialen Datensätzen war die Wahrscheinlichkeit, dass Lysine auf CoABPs acetyliert, succinyliert oder glutaryliert wurden, 3,66-, 4,70- bzw. 5,28-mal höher als bei Lysinen auf Nicht-CoABPs (OR = 3,66, p = 1,48E−100; OR = 4,70, p =). 3,98E−75; OR = 5,28 bzw. p = 4,74E−62). Daher ist es in den Mitochondrien deutlich wahrscheinlicher, dass Lysinreste in CoABPs acyliert werden als solche in Nicht-CoABPs.

Als nächstes stellten wir die Hypothese auf, dass die CoA-Bindung selbst zur Lysin-Acylierung führt und infolgedessen Lysine in der Nähe einer CoA-Bindungsstelle mit höherer Wahrscheinlichkeit acyliert werden als diejenigen, die distal von CoA-Bindungsstellen liegen (Abb. 1). Um diese Hypothese zu testen, verwendeten wir Kristallstrukturen von CoA-bindenden Proteinen und Computermodelle der CoA-Bindung an strukturell definierten Stellen, um zu bestimmen, ob proximale Lysine durch Acylierung angereichert waren.

Innerhalb des CoA-Moleküls ist die Acylgruppe an eine Thiolgruppe konjugiert, die über eine ca. 15 Å große prosthetische Gruppe mit 9 rotationsvariablen Einzelbindungen und 2 konformativ variablen Peptidbindungen an eine Kern-Phospho-ADP-Einheit gebunden ist (Abb. 3a). Die terminale Acylgruppe dieses großen, flexiblen Moleküls kann relativ zur Kern-Phospho-ADP-Einheit mehrere Positionen einnehmen, und die Berechnung des physikalischen Abstands zwischen einem Lysinrest und der Acylgruppe eines an ein Protein gebundenen Acyl-CoA-Thioesters ist nicht einfach. nach vorne. Kristallstrukturen sind für CoA verfügbar, das an viele aktive Proteinzentren gebunden ist, und wir haben diese Informationen genutzt, um ein Ensemble von ~ 2000 Modellen sterisch gültiger CoA-Konformationen zu berechnen (Abb. 3a, ergänzender Codetext). Diese Modelle wurden ausgewählt, um die größtmögliche Streuung der terminalen CoA-Schwefelpositionen zu erreichen. AMP ist der größte konformationell starre Unterabschnitt des CoA-Moleküls, und deshalb haben wir dieses Konformationsensemble an Homologiemodelle von CoABP angepasst, indem wir die AMP-Einheit als Ziel und die Untergruppe unserer CoA-Ensemble-Konformationen verwendet haben, die sterisch zu jedem Proteinmodell passten (Abb . 3a). Das Ensemble der sterisch gültigen CoA-Konformationen jedes Proteins beschreibt eine Reihe von Thiol-Schwefel-Positionen, die wiederum eine Reihe von Abständen zur Amingruppe jedes potenziell acylierten Lysinrests definieren. Für jedes analysierte CoABP wurde der minimale Abstand zwischen jedem Lysinrest aus dem angepassten CoA-Konformationsensemble berechnet. (Abb. 3a).

Die Strukturmodellierung der CoA-Konformation zeigt eine proximale Hyperacylierung in der Nähe von CoA-Bindungsstellen (a) Schematische Darstellung des rechnerischen Ansatzes zur Berechnung des minimalen Abstands zwischen einem Lysinrest und der Thiolgruppe des CoA in einer Protein-CoA-Bindungstasche. Durch die Kombination experimentell beobachteter Bindungsdrehwinkel aus CoA-Kristallstrukturen nach der Phospho-ADP-Einheit wurde ein Konformationsensemble physikalisch plausibler CoA-Konformationen erstellt. Vollständige Strukturmodelle von CoA-bindenden Proteinen aus acylomischen Datensätzen wurden mit Swissmodel erstellt. Das CoA-Ensemble wurde an jedes Proteinmodell angedockt, um einen Satz sterisch zugänglicher CoA-Thiol-Positionen zu generieren, und zur Bewertung des Amin-Thiol-Abstands jedes modellierten Lysinrests verwendet. (b) Tabelle mit der Anzahl der nicht acylierten und acylierten Lysinreste, die auf CoA-bindenden Proteinen gefunden wurden. Für jede Acetylierung, Succinylierung und Glutarylierung wurde das relative Wahrscheinlichkeitsverhältnis für CoA-erreichbare Lysine (< 5 Å vom nächsten CoA-Ensemble-Schwefel entfernt) acyliert im Vergleich zu weiter entfernt liegenden Lysinresten berechnet. Die Signifikanz der Ergebnisse wurde mithilfe des exakten Fisher-Tests berechnet. (c) Relative Wahrscheinlichkeit der Lysin-Acylierung an CoA-bindenden Protein-Lysinen als Funktion des Abstands eines Lysins vom CoA-Ensemble. Daten für Acetylierung, Succinylierung und Glutarylierung.

Wir verwendeten einen Abstand von 5 Å zwischen dem Lysinamin und dem CoA-Schwefel als Grenzwert für die enge Bindungsstellennähe und modellierten wiederum Acylierungsbeobachtungen als Odds Ratio. Dieser Abstand wurde empirisch gewählt, um die begrenzte Probendichte der CoA-Schwefelpositionen und die Zurückweisung von CoA-Schwefelpositionen mit Van-der-Waals-Überlappung zu Lysin-Amin-Atomen zu kompensieren36. Die OR-Werte für CoA-erreichbare Lysine, die acetyliert, succinyliert und glutaryliert wurden, betrugen 1,73, 2,62 bzw. 3,03, und diese erhöhten Acylierungschancen waren alle signifikant (Abb. 3b). Indem wir den kumulativen Anteil aller modellierten CoABP-Lysine innerhalb einer bestimmten Entfernung vom CoA-Ensemble aufzeichneten, beobachteten wir, dass Lysine in der Nähe der CoA-Bindungsstelle zwei- bis dreimal häufiger acetyliert, succinyliert und glutaryliert wurden als weiter entfernte Lysine (Abb . 3c). Mit zunehmendem Abstand verringerte sich die Wahrscheinlichkeit einer Acylierung auf den Hintergrundwert (Abb. 3c). Diese Ergebnisse bestätigten unsere Hypothese und zeigten, dass die Lysin-Acylierung in der Nähe von CoA-Bindungsstellen signifikant erhöht war.

Als nächstes wollten wir verifizieren, dass der Anstieg der Acylierung in der Nähe von CoA-Bindungsstellen spezifisch für CoA war. CoA teilt eine Kern-ADP-Einheit mit verwandten Molekülen (z. B. ADP, ATP, NAD und NADP) (Abb. 4a). Im letzten Schritt der CoA-Synthese wird der Ribosegruppe jedoch ein Phosphat an einer für CoA einzigartigen Position hinzugefügt, wodurch CoA möglicherweise sterisch von den Bindungsstellen ausgeschlossen wird, die von diesen verwandten Molekülen verwendet werden. Das 3′-Phosphat-CoA-Molekül wird typischerweise durch eine stark positiv geladene Bindungsstelle gebunden, was entweder Lysin- oder Argininreste in Proteinsequenzen erfordert und zu einer statistischen Anreicherung von Lysinen in der Nähe von CoA-Bindungsstellen führt37,38. Da die verwandten Moleküle ähnliche Größen und polyvalente negative Ladungen wie CoA haben, hängen ihre Bindungsstellen auch von positiv geladenen Aminosäuren ab. Angesichts der Zunahme der Acylierung in der Nähe von CoA-Bindungsstellen (Abb. 3b, c) können lokale Ladungseffekte zu einer unspezifischen CoA-Bindung und anschließenden Acylierung führen. Um diese Möglichkeit auszuschließen, verglichen wir die Acylierung in der Nähe von NAD/NADP-Bindungsstellen mit CoA-Bindungsstellen, um festzustellen, ob der lokale Ladungseffekt ausreicht, um die lokale Acylierung voranzutreiben (Abb. 4b, c). Wir haben die sterische Zugänglichkeit von CoA für NAD[P]-Stellen modelliert, indem wir das gleiche Protokoll wie CoA und die gemeinsame ADP-Einheit als Basis für die Bestimmung der Bindungsstellennähe für Lysine auf NAD[P]-bindenden Proteinen verwendet haben. Unter erneuter Verwendung von 5 Å als Grenzwert für eine enge Bindung beobachteten wir keine höhere Wahrscheinlichkeit der Glutarylierung in CoA-erreichbaren Lysinen in NAD[P]-bindenden Proteinen, da kein glutaryliertes Lysin tatsächlich „CoA-erreichbar“ war (Abb. 4b). Im Gegensatz zu CoABPs, bei denen die Acylierungswahrscheinlichkeit mit der Nähe des Lysins zu einer CoA-Bindungsstelle signifikant zunahm, wurden bei Lysinen in der Nähe von NAD- und NADP-Bindungsstellen keine signifikanten Änderungen der Acylierung beobachtet (Abb. 4b, c). Somit ist die Acylierungsanreicherung in der Nähe von CoA-Bindungsstellen spezifisch für CoA-Bindungsstellen und kann nicht durch einen allgemeineren Ladungseffekt erklärt werden.

Die proximale Hyperacylierung ist spezifisch für CoA-Bindungsstellen. (a) Darstellung der strukturellen Ähnlichkeiten zwischen CoA und ADP, ATP, NAD und NADP. CoA hat eine zentrale ADP-Einheit mit ATP, NAD und NADP gemeinsam, seine hinzugefügte 3′-Phosphorylgruppe kann jedoch verhindern, dass es in die Bindungsstellen dieser Spezies passt. (b) Tabelle zum Vergleich der relativen Wahrscheinlichkeitsverhältnisse von CoA-erreichbaren Lysinen, die durch CoA-bindendes Protein und NAD[P]-bindendes Protein glutaryliert werden. (c) Relative Wahrscheinlichkeit der Lysin-Acylierung als Funktion des Abstands eines Lysins vom CoA-Ensemble, das in [Acyl-]CoA-, NAD- und NADP-Bindungsstellen eingebaut ist, was einen Mangel an Acylierungsanreicherung in der Nähe von NAD- und NADP-Bindungsstellen zeigt.

Ein wahrscheinlicher Mechanismus, der unsere Beobachtungen erklären würde, besteht darin, dass Acyl-CoAs CoA-Bindungsstellen besetzen und ihre Acylgruppe entweder direkt oder unter Verwendung benachbarter Cysteinreste als Zwischenprodukte auf nahegelegene Lysinreste übertragen39. In Übereinstimmung mit diesem Modell führt die Inkubation von CoABPs mit Acetyl-CoA oder Succinyl-CoA nach einem Zeitraum von Stunden zu einer nachweisbaren Hyperacetylierung12. Wenn diese Hypothese richtig ist, können wir erwarten, dass (1) Lysinreste in der Nähe der CoA-Bindungsstelle schneller acyliert werden und (2) die Acylierung durch einen Überschuss an nicht acyliertem CoA kompetitiv gehemmt wird (Abb. 5a). .

In-vitro-Succinylierung von ECHS1 mit Succinyl-CoA wird durch CoA kompetitiv gehemmt (a) Schematische Darstellung der Succinylierung von ECHS1 durch Succinyl-CoA (Su-CoA) und Hemmung durch CoA. (b) Western-Blot von humanem rekombinantem ECHS1 mittels nativer Gelelektrophorese. (c) Western-Blot-Nachweis der Succinyllysin (SuK)-Spiegel in ECHS1 und BSA, co-inkubiert mit Su-CoA in Gegenwart und Abwesenheit von CoA für unterschiedliche Zeiten (5, 15 und 45 Minuten und 2 Stunden). (d) Abstand einzelner Lysinreste zu CoA auf ECHS1. (e) Massenspektrometrie-Zeitverlaufsexperiment zur Messung der Änderung der Succinylierungsniveaus bei einzelnen Lysinen auf ECHS1. ECHS1 wurde mit 400 µM Su-CoA für 0, 5, 15 oder 45 Minuten und mit 0, 1 oder 10 mM CoA co-inkubiert. Die Häufigkeit der SuK-Spiegel für jeden Rückstand wurde auf die ECHS1-Negativkontrolle (nicht mit CoA oder Su-CoA behandelt) normalisiert (N = 4 pro Behandlung). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001; ns, nicht signifikant. Es wurde eine einfaktorielle ANOVA durchgeführt. Bei den nicht mit CoA behandelten Erkrankungen wurde jeder Zeitpunkt mit der 0-Minuten-Gruppe verglichen. Unter den 45-Minuten-Bedingungen wurden beide mit CoA behandelten Gruppen (1 und 10 mM) mit der Gruppe verglichen, die nicht mit CoA behandelt wurde.

Wir wollten diese Hypothese mithilfe rekombinanter Enoyl-CoA-Hydratase, kurzkettig 1 (ECHS1), gereinigt aus E. coli, testen. ECHS1 ist ein mitochondriales CoABP mit 30,6 kDa. ECHS1 bildet Homohexamere und die native Gelelektrophorese bestätigte, dass gereinigtes ECHS1 in einem hochgradig multimerisierten Zustand vorlag (Abb. 5b). Da eine endogene Acetylierung häufig bei bakteriell exprimierten Proteinen auftritt, verwendeten wir für die meisten Experimente Succinyl-CoA als Modell-Acyl-CoA. ECHS1 wurde mit Succinyl-CoA (400 μM) inkubiert und wir haben gemessen, wie sich eine zunehmende Inkubationszeit (5, 15, 45 und 120 Minuten) auf die Succinylierung von ECHS1 auswirkte. Als Nicht-CoABP-Kontrolle wurde Rinderserumalbumin (BSA) verwendet. Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass die durch Succinyl-CoA-Inkubation induzierten Succinylierungsniveaus in beiden Proteinen zeitabhängig erhöht waren (Abb. 5c). Wichtig ist, dass die gleichzeitige Inkubation mit einem 25-molaren Überschuss an CoA (10 mM) die Succinylierung von ECHS1 stark inhibierte, nicht jedoch die von BSA. Dies legt nahe, dass die Succinylierung durch Succinyl-CoA teilweise von seiner Wechselwirkung mit der ECHS1-CoA-Bindungstasche abhängt und dass die CoA-Hemmung spezifisch für CoABPs ist (Abb. 5a).

Um die unterschiedlich succinylierten Lysinstellen im Detail zu charakterisieren, wurde die ECHS1-Succinylierung durch Flüssigkeitschromatographie, datenabhängige Erfassungs-Tandem-Massenspektrometrie (LC-DDAMS/MS) nach Proteingelreinigung und Trypsinverdau im Gel analysiert. Wir beobachteten, dass 10 von 24 Lysinresten in ECHS1 (Abb. 5d) durch Inkubation mit Succinyl-CoA succinyliert wurden. Bemerkenswert ist, dass K284 und K288 innerhalb desselben disuccinylierten Peptids nicht unterschieden werden können. In Übereinstimmung mit den Western-Blot-Ergebnissen stiegen die durch Succinyl-CoA-Inkubation induzierten Succinylierungsgrade an jedem dieser Lysinreste (K282, K284/K288, K43, K204, K234, K273, K127, K261, K118) im Laufe der Zeit an -abhängige Weise bei 0, 5, 15 und 45 Minuten (Abb. 5e). Darüber hinaus wurde die Succinylierung von ECHS1 an diesen Lysinresten durch CoA gehemmt. Somit wurde die Succinylierung einzelner Lysinreste auf ECHS1 durch CoA konzentrationsabhängig gehemmt.

Um die Empfindlichkeit einzelner Lysinreste gegenüber CoA-Hemmung zu bestimmen, inkubierten wir rekombinantes ECHS1 mit Succinyl-CoA (400 μM) und steigenden CoA-Konzentrationen (0–10 mM). Nach Proteinverdau und LC-MS/MS-Analyse erhielten wir robuste MS-Daten für sieben Lysinreste (d. h. K282, K284/K288, K43, K204, K234 und K118). Wichtig ist, dass die Succinylierung durch die zunehmende CoA-Konzentration kompetitiv gehemmt wurde (Abb. 6a), und der IC50-Wert für jede dieser Hemmkurven lag im Bereich von 331 bis 1924 μM. Als nächstes fragten wir für jeden succinylierten Lysinrest, ob die CoA-induzierte Hemmung durch seinen Abstand zur CoA-Bindungstasche beeinflusst wurde. Die Lysinabstände zur CoA-Bindungstasche wurden mit der gleichen Methode wie oben beschrieben (Abb. 3a) berechnet, wobei die ECHS-Kristallstruktur (PDB-ID: 2HW5) verwendet und der Satz sterisch zugänglicher Konformationen für CoA berechnet wurde. Wir haben die Lysinabstände von der CoA-Bindungstasche mit den IC50-Werten aufgezeichnet und eine lineare Regressionsanalyse durchgeführt. Wir beobachteten eine positive Beziehung zwischen dem Lysinabstand von der CoA-Bindungstasche und dem IC50 jedes Rests (R2 = 0,8235) (Abb. 6b). Dies zeigte, dass Lysine, die näher an der CoA-Bindungstasche liegen, empfindlicher auf die CoA-Hemmung reagieren als weiter entfernte Lysine. Insgesamt deuten diese Experimente darauf hin, dass die Lysin-Succinylierung in der Nähe der ECHS1-CoA-Bindungstasche durch Acyl-CoA-Bindung vermittelt wird und einer kompetitiven Hemmung durch CoA unterliegt (Abb. 1).

Die CoA-Hemmung an einer bestimmten Lysinstelle korreliert umgekehrt mit der Entfernung zur CoA-Bindungstasche. (a) Inhibitionskurve und IC50 pro Rest für CoA, das die Succinylierung einzelner Lysinreste auf ECHS1 hemmt. ECHS1 wurde mit Succinyl-CoA und steigenden CoA-Konzentrationen inkubiert. Dosis-Wirkungs-Kurven wurden als Logarithmus der CoA-Konzentration gegenüber der SuK-Hemmung ausgedrückt. Die prozentuale Hemmung für jeden Rest wurde berechnet, indem die prozentuale Änderung zwischen den Succinylierungsniveaus gemessen wurde, wenn ECHS1 45 Minuten lang mit Succinyl-CoA in Gegenwart und Abwesenheit einer CoA-Behandlung co-inkubiert wurde. N = 4 pro Behandlung. (b) Diagramm, das die korrelative Beziehung zwischen Lysinrestabständen und IC50 (μM) zeigt (N = 5, R2 = 0,8235). In der MS-Analyse wurden die Succinylierungsgrade für K284 und K288 kombiniert, da beide Reste nach der Trypsinisierung ausschließlich auf einem gemeinsamen Peptid gefunden wurden. Daher wurden diese Standorte nicht zur Generierung des R2-Werts oder der Trendlinie verwendet und sind in der Grafik als rote Punkte enthalten.

Zusätzlich zu diesem Succinylierungsexperiment führten wir ein ähnliches Acetylierungsexperiment mit rekombinantem ECHS1-Protein durch, das mit Acetyl-CoA und CoA inkubiert wurde. Da die endogene Acetylierung bei bakteriell exprimierten Proteinen erfolgt40, haben wir die Acetylierung nur an drei Lysinstellen in der Nähe der CoA-Bindungstasche analysiert. In ähnlicher Weise zeigten die Ergebnisse der MS-Analyse, dass die durch Acetyl-CoA-Inkubation induzierte Acetylierung an Lysinresten in der Nähe der CoA-Bindungstasche (K282, K284 und K204) in ECHS1 durch einen 25-molaren Überschuss an CoA gehemmt wurde (Abb. 7). Diese Ergebnisse legen nahe, dass CoA allgemeiner die Acyl-CoA-induzierte Lysin-Acylierung in der Nähe von CoA-Bindungstaschen für mehrere unterschiedliche Acylierungsspezies hemmt.

Die In-vitro-Acetylierung von ECHS1 mit Acetyl-CoA wird durch CoA an Lysinen in der Nähe der CoA-Bindungsstelle kompetitiv gehemmt. (a) Die Acetylierung an drei Stellen auf bakteriell produziertem rekombinantem ECHS1 nimmt in vitro nach der Zugabe von Acetyl-CoA zu, und diese Stellen befinden sich in der Nähe der CoA-Bindungsstelle. Diese Acetylierung über exogenes Acetyl-CoA wird durch Zugabe eines molaren Überschusses an CoA gehemmt.

Mithilfe von Computermodellen, die durch In-vitro-Experimente validiert wurden, haben wir gezeigt, dass die Acylierung in der Nähe des aktiven Zentrums von CoABPs verstärkt ist. Unsere Ergebnisse zeigen insbesondere: (1) CoABPs werden deutlich häufiger acyliert, insbesondere in den Mitochondrien, (2) Lysine, die sich physisch in der Nähe der CoA-Bindungsstelle befinden, werden eher acyliert als solche, die weit entfernt sind, (3) in Die -vitro-Acylierung von CoABP hängt von der Acyl-CoA-Bindung ab, und (4) Lysine in der Nähe der CoA-Bindungsstelle reagieren empfindlicher auf Hemmung als distale Lysine. Diese Studie legt nahe, dass die proximale Acylierung an Protein-CoA-Bindungsstellen ein primärer Mechanismus für die Lysin-Acylierung in den Mitochondrien ist.

Proteinmodifikationsreaktionen wie Phosphorylierung, Acylierung oder Glykosylierung werden typischerweise von speziellen Transferaseenzymen durchgeführt, die Reaktionsübergangszustände stabilisieren und das modifizierte Protein und einen kleinen Molekülvorläufer zusammenbringen41,42,43. Im Fall der bindungsstellenvermittelten proximalen Acylierung nutzt die Reaktion eine vorgebildete Bindungsstelle für CoA (wie bei der kanonischen enzymatischen Katalyse), aber keine spezifische Stabilisierung der Übergangsstelle (wie bei nicht-enzymatischen Reaktionen). Die CoA-vermittelte proximale Acylierung weist Merkmale sowohl enzymatischer als auch nicht-enzymatischer Reaktionen auf und könnte als „semienzymatischer“ Reaktionsmechanismus qualifiziert werden, der eine Klasse verwandter Nebenreaktionen auf chemisch selektive und sterisch eingeschränkte Weise verstärkt. Diese semienzymatischen Reaktionen könnten möglicherweise eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Zellstoffwechsels spielen. Insbesondere CoA-bindende Bindungsstellen weisen häufig Lysinreste auf, die eine wichtige Rolle bei der Bindung von negativ geladenem CoA spielen, und frühere Arbeiten unserer Gruppe und anderer haben gezeigt, dass diese Reste in vivo acyliert werden und dass Mutationen, die die Acylierung nachahmen, die Enzymfunktion verringern30,44 . Die semienzymatische Acylierung bietet möglicherweise einen Mechanismus für CoA-bindende Enzyme, sich im Laufe der Zeit durch Autoacylierung selbst zu hemmen, wobei die Geschwindigkeit abhängig von den lokalen Konzentrationen von reinem CoA im Vergleich zu Acyl-CoA ist. Inwieweit die semienzymatische Acylierung die Proteinfunktion reguliert und zu Stoffwechselprozessen beiträgt, wird eine spannende Frage sein, die in zukünftigen Studien behandelt werden muss.

CoA-Thioester teilen sowohl (1) eine gemeinsame Bindungseinheit, die eine Vielzahl von Bindungsstellen im gesamten Proteom besetzen kann, als auch (2) eine hochreaktive terminale Bindung, die eine Acylnutzlast auf eine gemeinsame nahegelegene chemische Gruppe überträgt. Diese beiden Faktoren erzeugen eine große Anzahl nachweisbarer PTMs im gesamten Proteom und ermöglichen die oben beschriebenen rechnerischen Analysen. Andere reaktive Metaboliten könnten jedoch das gleiche Verhalten zeigen, wenn auch auf weniger Proteinen. Andere PTM-erzeugende Reaktionen wie 1,3-Bisphosphoglycerat45 zeigen ähnliche Muster der Geschwindigkeitssteigerung in der Nähe von Bindungsstellen für PTM-Vorläufermetaboliten. Obwohl der daraus resultierende Satz von PTMs auf anderen reaktiven Metaboliten möglicherweise nicht weit genug verbreitet ist für den proteomischen LC-MS/MS-basierten Nachweis und die Analyse, können gezieltere Techniken die Hemmung eines breiteren Satzes von Stoffwechselenzymen als Nebenwirkung der von ihnen katalysierten Reaktionen feststellen. Wir glauben, dass die Kombination des hier verwendeten rechnerischen und experimentellen Ansatzes neue Mechanismen im Bereich der Acylierung aufgedeckt hat, und wir gehen davon aus, dass sie auch Mechanismen für andere PTMs beleuchtet, die durch reaktive Metaboliten oder Medikamente induziert werden.

Im Jahr 2020 haben James et al. berichteten, dass Enzyme, die die ADP-bindende Rossman-Faltung enthalten, an der Autoacylierung beteiligt sind, ähnlich unseren Beobachtungen32. Insbesondere zeigten sie, dass die Automalonylierung durch das NAD- und ATP-bindende Enzym Glutamatdehydrogenase (GDH) (1) durch einen molaren Überschuss an reinem CoA gehemmt wurde und (2) bei Lysinresten in der Nähe der Nukleotidbindungsstellen der GDH stärker inhibiert wurde. Mithilfe einer linearen Abstandsfunktion anstelle eines strukturell modellierten CoA-Ensembles stellten sie außerdem fest, dass die Acetylierungsstöchiometrie für Lysinreste in der Nähe von Nukleotidbindungsstellen auf Enzymoberflächen im Durchschnitt geringfügig höher war. Unsere Studie bestätigt und erweitert die Gültigkeit ihrer Erkenntnisse. Erstens beobachteten wir durch die parallele Betrachtung mehrerer Acylierungssubtypen einen Anstieg der Anreicherung multivalenter saurer Modifikationen wie Glutarylierung und Succinylierung gegenüber der Acetylierung. Während für diese multivalenten Modifikationen zuvor höhere Lysin-Acylierungsraten berichtet wurden15, zeigt unsere Studie, dass dieser Effekt durch die lokale Proteinstruktur, insbesondere um eine CoA-Bindungstasche, weiter verstärkt wird. Zweitens, während James et al. über eine NAD-Bindungsstellen-gesteuerte Automalonylierung für GDH berichteten, konnten wir diesen Effekt auf proteomweiter Ebene nicht beobachten. Sie zeigten, dass NAD im Vergleich zu reinem CoA ein schlechterer Inhibitor der Autoacylierung in mitochondrialen Proteinextrakten ist und dass andere ADP-Derivate in ihrer Wirkung zwischen NAD[P][H] und reinem CoA lagen. Wir vermuten, dass, während einige Untergruppen von NAD-Bindungsstellen CoA effizient für die Autoacylierung durch Acyl-CoA-Spezies binden, viele andere dies nicht tun. Die Neigung von GDH zur inhibitorischen Acylierung könnte daher ein Ausreißer unter den NAD-bindenden Enzymen sein. Im Gegensatz dazu sollte jedes Protein, das CoA für seine kanonische Funktion binden kann, einen gewissen Grad an Autoacylierung aufweisen, obwohl weitere Untersuchungen erforderlich sind, um die Unterschiede in den Geschwindigkeiten zwischen Enzymen als Folge ihrer Struktur besser zu verstehen.

Schließlich haben wir durch die rechnerische Analyse von Daten von mehreren hundert Proteinen in veröffentlichten Datensätzen und die Validierung unseres Rechenmodells mithilfe eines einzelnen CoA-bindenden Proteins gezeigt, dass die Acylierung des mitochondrialen CoA-bindenden Proteins durch die Bindung von Acyl-CoA-Spezies an die CoA-Bindungstasche erfolgt. Weitere Studien werden notwendig sein, um die Gültigkeit unserer Ergebnisse zu erweitern, aber wir hoffen, dass Forscher, die sich für Acylierung interessieren, mit dieser Veröffentlichung damit beginnen können, den Einfluss der biochemischen und strukturellen Eigenschaften von Proteinen auf die verschiedenen Acylierungen, die sie anhäufen, quantitativ zu analysieren. Letztendlich sollten detailliertere mechanistische Modelle auch dabei helfen, die Stoffwechselbedingungen zu identifizieren, bei denen diese PTMs den größten Einfluss auf die Biologie haben.

Zur Generierung von UniProt-IDs wurden Listen beobachteter Peptide aus veröffentlichten Zusatzinformationen früherer MS-Studien verwendet. Ein Protein wurde als CoA-bindend angesehen, wenn seine enzymatische Aktivität ein beliebiges CoA-Derivat umfasste, ein beliebiges CoA-Derivat als Ligand annotiert war oder eine annotierte CoA-Derivat-Bindung oder ein aktives Zentrum aufwies. Ähnliche Verfahren wurden für NAD- und NADP-bindende Proteine ​​durchgeführt.

Für jedes CoA- oder NAD[P]-bindende Protein wurden Homologiemodelle mit den interaktiven Modellbildungstools von Swissmodel46 erstellt. Proteine ​​mit Homologiemodellen wurden einer Strukturausrichtung durch PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC) gegenüber dem Satz experimentell bestimmter Kristallstrukturen mit gebundenem CoA unterzogen, wobei Python-Skripte zum Einrichten und Vergleichen von Ausrichtungen verwendet wurden. Spitzenpaare acylierter Proteinhomologiemodelle und strukturell ähnlicher CoA-gebundener Proteine ​​wurden verwendet, um CoA-Platzierungen im Kontext acylierter Homologiemodelle zu generieren, wobei nur die CoA-lokalen Proteinreste innerhalb von 20 Å von CoA-Phosphatatomen als strukturelles Ausrichtungsziel verwendet wurden.

Nach der Platzierung wurde die basische Phospho-AMP-Einheit von CoA als Ausrichtungsziel verwendet, um ein selbstvermeidendes CoA-Konformationsensemble zu platzieren, aus dem dann jede CoA-Bestätigung ausgeschlossen wurde, wenn sie mehr als 1 Å3 Kollisionsvolumen mit dem Proteinmodell teilte. Dieses gemeinsam eingegebene CoA-Konformationsensemble wurde durch die Anwendung von Rückgrat-Diederwinkeln bestehender CoA-Ligandenstrukturen aus RCSB47 erzeugt, um eine idealisierte CoA-Ligandenstruktur zu drehen. Einzelne Konformationen wurden durch zufällige Stichproben von experimentell gemessenen Grundgerüsten erzeugt und iterativ in das endgültige Modell übernommen, wenn ihr terminales Thiol mehr als einen Schwefelatom-Van-der-Waals-Radius von jedem anderen Modell im Satz entfernt war, bis 2000 Konformationen ausgewählt wurden.

Für NAD[P]-Bindungsstellen wurde der gemeinsame AMP-Kern von CoA und NAD[P] verwendet, um das CoA-Konformationsensemble zu platzieren; Die Modellierung erfolgte ansonsten genauso wie für CoA-bindende Proteine.

Den Lysinresten aller Homologiemodelle mit aufgebauten CoA-Ensembles wurde ein Abstandswert vom Zentrum des terminalen primären Aminatoms jedes Lysins zum Zentrum des nächstgelegenen Thiolschwefelatoms im Satz sterisch gültiger CoA-Konformationen des Modells zugewiesen.

Für jeden berücksichtigten Lysin-Acylierungs-Subtyp (Acetylierung, Succinylierung und Glutarylierung) haben wir Lysinreste aus allen Homologiemodellen bewertet, bei denen in der entsprechenden proteomischen MS-Studie mindestens ein modellierter Lysinrest beobachtet wurde. Einzelne acylierte Lysinreste im Vergleich zu nicht acylierten Lysinresten unter diesen acylierten Proteinen wurden in Verbindung mit den oben beschriebenen Abstandswerten verwendet, um die relative Anreicherung der Acylierung innerhalb von X Angström des CoA-Ensembles zu berechnen, und es wurde der in Scipy.stats48 implementierte Fisher's Exact Test verwendet Wird verwendet, um die statistische Signifikanz der Anreicherung zu bewerten.

Der für diese Studie entwickelte Code ist unter https://github.com/ccarrico/CoABindingSiteAnalyses verfügbar.

Rekombinante Enoyl-CoA-Hydratase-Kurzkette 1 (ECHS1) (0,3 µg/µL) wurde von Novus Biologicals gekauft und in 50 mM Tris, pH 8, 150 mM NaCl mit unterschiedlichen CoA-Konzentrationen (0–10 mM) bei 37 °C gelöst . Die Reaktion wurde durch Zugabe von Succinyl-CoA oder Acetyl-CoA bei 37 °C gestartet. Die Reaktionen wurden durch Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff gestoppt und bis zur Verarbeitung bei –80 °C gelagert.

Zur Trennung von ECHS1 oder BSA wurden Polyacrylamidgele (10–15 %) verwendet. Das Protein wurde mit dem BioRad-Blotsystem auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Die Membranen wurden mit 5 % BSA in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween 20, pH 7,4) blockiert und mit Anti-Succinyl-Lysin (PTM Biolabs) sondiert, dann mit sekundärem Antikörper in Milch in Tris sondiert -gepufferte Kochsalzlösung, inkubiert mit Antikörpern. Chemilumineszenzintensitäten wurden mit dem ChemiDoc-Bildgebungssystem (BioRad, Hercules, CA) erfasst.

Für die MS-Experimente wurden 3 µg ECHS1 mit 400 µM Succinyl-CoA für 0, 5, 15 oder 45 Minuten und mit 0, 1 oder 10 mM CoA (Puffer: 50 mM Tris, pH 8,0 und 150) co-inkubiert mM NaCl). Jede Bedingung enthielt vier Wiederholungen.

Jede Probe, die 3 µg ECHS1-Stammprotein enthielt, wurde 10 Minuten lang bei 70 °C in 50 mM Dithiothreitol (DTT) und Laemmli-Probenpuffer inkubiert. Die Proben wurden 20 Minuten lang in vorgefertigten 4–12 % Bis-Tris-Stapelgelen laufen gelassen. Am folgenden Tag wurde ein In-Gel-Verdau durchgeführt. Die Gelbänder wurden in Würfel geschnitten, in Röhrchen gesammelt und mit einem Dehydratisierungspuffer (25 mM Ammoniumbicarbonat in 50 % Acetonitril und Wasser) dehydriert. Die Gelproben wurden im Schnellvakuum getrocknet, mit 10 mM DTT reduziert und 1 Stunde lang bei 56 °C unter Rühren inkubiert, anschließend mit 55 mM Iodacetamid alkyliert und 45 Minuten lang bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Die gewürfelten Gele wurden mit 25 mM Ammoniumbicarbonat in Wasser gewaschen und dann erneut mit dem Dehydratisierungspuffer dehydriert. Die Proben wurden erneut im Schnellsauger getrocknet, anschließend wurden die Proteine ​​30 Minuten lang bei 4 °C in 250 ng Trypsin inkubiert und über Nacht bei 37 °C unter Rühren verdaut. Am nächsten Morgen wurden die Aufschlüsse Wasser und dann 50 % Acetonitril und 5 % Ameisensäure in Wasser ausgesetzt. Nach jeder Lösungszugabe wurde der wässrige Aufschluss jeder Probe in einem neuen Röhrchen gesammelt. Diese gepoolten Peptidextraktionen wurden 2 Stunden lang im Schnellvakuum getrocknet, um Trockenheit zu erreichen, und dann in 0,2 % Ameisensäure resuspendiert.

Die resuspendierten Peptidproben wurden mit Zip Tips, die eine C18-Scheibe enthielten, entsalzt, konzentriert und in wässriger 0,2 %iger Ameisensäure resuspendiert, die massenspektrometrische „Hyper Reaction Monitoring“-Retentionszeit-Peptidstandards enthielt (iRT, Biognosys, Schlieren, Schweiz).

Kurz gesagt, die Proben wurden durch Umkehrphasen-HPLC-ESI-MS/MS unter Verwendung eines Eksigent Ultra Plus nano-LC 2D-HPLC-Systems (Dublin, CA) mit einem cHiPLC-System (Eksigent) analysiert, das direkt mit einem Quadrupol-Timer verbunden war -Flug (QqTOF) TripleTOF 6600 Massenspektrometer (SCIEX, Concord, CA). Nach der Injektion wurden die Peptidmischungen auf einen C18-Vorsäulenchip (200 µm × 0,4 mm ChromXP C18-CL-Chip, 3 µm, 120 Å, SCIEX) geladen und 10 Minuten lang mit 2 µl/min mit dem Ladelösungsmittel (H2O) gewaschen /0,1 % Ameisensäure) zum Entsalzen. Anschließend wurden die Peptide auf den 75 µm × 15 cm großen ChromXP C18-CL-Chip, 3 µm, 120 Å, (SCIEX) übertragen und mit einer Flussrate von 300 nL/min mit einem 2-stündigen Gradienten mit wässrigem und Acetonitril-Lösungsmittel eluiert Puffer.

Datenabhängige Erfassungen (zum Aufbau der Spektralbibliothek): Zur Peptid- und Proteinidentifizierung wurde das Massenspektrometer im datenabhängigen Erfassungsmodus (DDA) betrieben, in dem die 30 am häufigsten vorkommenden Vorläuferionen aus dem MS1-Scan der Umfrage (250 ms) isoliert wurden bei 1 m/z Auflösung für kollisionsinduzierte Dissoziations-Tandem-Massenspektrometrie (CID-MS/MS, 100 ms pro MS/MS, Produkt-Ionen-Scanmodus „hohe Empfindlichkeit“) unter Verwendung der Software Analyst 1.7 (Build 96) mit einem Gesamtzyklus Zeit von 3,3 s wie beschrieben49.

Datenunabhängige Erfassungen: Zur Quantifizierung wurden alle Peptidproben durch datenunabhängige Erfassung (DIA, z. B. SWATH) unter Verwendung von 64 Isolationsfenstern variabler Breite analysiert50,51. Die variable Fensterbreite wird entsprechend der Komplexität des typischen MS1-Ionenstroms angepasst, der innerhalb eines bestimmten m/z-Bereichs beobachtet wird, unter Verwendung eines DIA-Algorithmus „Variable Fenstermethode“ (engere Fenster wurden in „belebten“ m/z-Bereichen gewählt, breite Fenster). in m/z-Bereichen mit wenigen eluierenden Vorläuferionen). DIA-Erfassungen erzeugen komplexe MS/MS-Spektren, die sich aus allen Analyten innerhalb jedes ausgewählten Q1-m/z-Fensters zusammensetzen. Die DIA-Zykluszeit von 3,2 s umfasste einen Vorläuferionenscan von 250 ms, gefolgt von einer Akkumulationszeit von 45 ms für jedes der 64 variablen SWATH-Segmente.

Massenspektrometrische DDAs wurden mithilfe der Datenbanksuchmaschine ProteinPilot (SCIEX 5.0, Revision 4769) unter Verwendung des Paragon-Algorithmus (5.0.0.0.4767)52 analysiert, wobei der Suchschwerpunkt auf „Succinylierung“ lag. Unter Verwendung dieser Datenbank-Suchmaschinenergebnisse wurde in Skyline Daily v20.2.1.404 eine MS/MS-Spektralbibliothek erstellt. Die DIA/SWATH-Daten wurden zur relativen Quantifizierung verarbeitet und die Peakflächen der acylierten Peptide unter verschiedenen Bedingungen verglichen. Für die DIA/SWATH MS2-Datensätze basierte die Quantifizierung auf XICs von 6–10 MS/MS-Fragmentionen, typischerweise y- und b-Ionen, passend zu spezifischen Peptiden, die in den Spektralbibliotheken vorhanden sind. Signifikante Änderungen wurden bei einem FDR von 5 % (q-Wert < 0,05) akzeptiert.

Massenspektrometrische Rohdaten wurden im MassIVE-Repository (MSV000089448) hinterlegt und sind auch bei ProteomeXchange (PXD033787) verfügbar. Der für diese Studie entwickelte Code ist unter https://github.com/ccarrico/CoABindingSiteAnalyses verfügbar.

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Referenzen herunterladen

Wir bedanken uns für den NIDDK Grant R24 DK085610 (Verdin) und für die Unterstützung der Instrumentierung durch den NCRR Shared Instrumentation Grant 1S10 OD016281 (Buck Institute). Wir danken außerdem der Larry L. Hillblom Foundation für ihre Unterstützung. Wir danken Gary Howards und John Carroll für ihre Hilfe bei der Bearbeitung des Manuskripts bzw. der Abbildungen.

Marius Walter

Derzeitige Adresse: Abteilung für Impfstoffe und Infektionskrankheiten, Fred Hutch Cancer Center, Seattle, WA, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Chris Carrico und Andrew Cruz.

Buck Institute for Research on Aging, Novato, CA, 94945, USA

Chris Carrico, Andrew Cruz, Marius Walter, Jesse Meyer, Cameron Wehrfritz, Samah Shah, Lei Wei, Birgit Schilling und Eric Verdin

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CC, AC und EV haben die Studie entworfen und die Daten analysiert. CC führte die rechnerische Modellierung durch. CC, AC führte molekularbiologische Experimente und Analysen durch. JM, CW, SS, LW und BS führten massenspektrometrische Experimente und Analysen durch. CC, AC, MW und EV haben das Manuskript mit dem Feedback aller Autoren geschrieben. BS und EV betreuten und finanzierten die Studie.

Korrespondenz mit Eric Verdin.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Carrico, C., Cruz, A., Walter, M. et al. Coenzym-A-Bindungsstellen induzieren eine proximale Acylierung über Proteinfamilien hinweg. Sci Rep 13, 5029 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31900-5

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Eingegangen: 28. Juli 2022

Angenommen: 20. März 2023

Veröffentlicht: 28. März 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-31900-5

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