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Aug 08, 2023

Strukturanalyse eines endogenen 4

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 552 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (OGDHc) ist am Tricarbonsäurezyklus beteiligt und decarboxyliert in einer mehrstufigen Reaktion α-Ketoglutarat, überträgt Succinyl auf CoA und reduziert NAD+. Aufgrund seiner zentralen Rolle im Stoffwechsel wurden die enzymatischen Komponenten von OGDHc isoliert untersucht; Ihre Wechselwirkungen innerhalb der endogenen OGDHc sind jedoch weiterhin unklar. Hier erkennen wir die Organisation eines thermophilen, eukaryotischen, nativen OGDHc in seinem aktiven Zustand. Durch die Kombination biochemischer, biophysikalischer und bioinformatischer Methoden können wir seine Zusammensetzung, 3D-Architektur und molekulare Funktion mit einer Auflösung von 3,35 Å aufklären. Wir berichten außerdem über die hochauflösende Kryo-EM-Struktur des OGDHc-Kerns (E2o), die verschiedene strukturelle Anpassungen aufweist. Dazu gehören Wasserstoffbrückenbindungsmuster, die die Interaktionen der an OGDHc beteiligten Enzyme (E1o-E2o-E3) einschränken, elektrostatisches Tunneln, das die Kommunikation zwischen Untereinheiten fördert, und das Vorhandensein einer flexiblen Untereinheit (E3BPo), die E2o und E3 verbindet. Diese mehrskalige Analyse eines Succinyl-CoA-produzierenden nativen Zellextrakts liefert eine Blaupause für Struktur-Funktions-Studien komplexer Mischungen von medizinischem und biotechnologischem Wert.

Der Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (OGDHc) ist einer der Hauptregulatoren des Stoffwechselflusses im Tricarbonsäurezyklus (TCA), was bedeutet, dass Zellen die OGDHc-Häufigkeit und -Aktivität unter strenger Kontrolle halten1,2. In Eukaryoten ist OGDHc im Mitochondrium aktiv, aber ein Teil des Komplexes lokalisiert sich auch im Zellkern und führt die Lysin-Succinylierung von Histonen durch3. Die OGDHc-katalysierte Reaktion – die Decarboxylierung von Oxoglutarat (α-Ketoglutarat) zu Succinyl-CoA – ist wichtig für die Energieproduktion, die metabolische Interaktion zwischen Mitochondrien und Zytoplasma sowie den Metabolismus von Neurotransmittern. Dies liegt daran, dass Oxoglutarat (α-Ketoglutarat) im TCA-Zyklus bei der Oxidation von Kohlenhydraten und Fettsäuren und durch Glutamatdehydrogenase bei der oxidativen Desaminierung von Glutamat entsteht. Es wird zusätzlich durch Glutamattransaminierung als Teil des Malat-Aspartat-Shuttles produziert, der reduzierende Äquivalente vom Zytoplasma auf die Mitochondrien überträgt. Diese entscheidende Stellung von OGDHc im Stoffwechsel und der Zusammenhang zwischen verminderter OGDHc-Aktivität im Gehirn und Neurodegeneration haben umfangreiche Forschungen angeregt4,5. Darüber hinaus reagiert OGDHc sehr empfindlich auf reaktive Sauerstoffspezies (ROS)6, und seine mögliche Hemmung aufgrund von oxidativem Stress könnte sich nachteilig auf den Gesamtstoffwechsel einer Zelle auswirken. Solche krebsbedingten Zellerkrankungen können die OGDHc-Aktivität beeinflussen7, insbesondere wenn man bedenkt, dass Oxoglutarat ein Effektor der p53-vermittelten Tumorsuppression ist8. Daher ist das Verständnis der Struktur-Funktions-Beziehungen von OGDHc von besonderem Interesse.

Auf molekularer Ebene ist OGDHc eine megadaltongroße Ansammlung mehrerer Kopien von drei Enzymen, nämlich E1o (Oxoglutaratdehydrogenase, EC 1.2.4.2), E2o (Dihydrolipoylsuccinyltransferase, EC 2.3.1.61) und E3 (Dihydrolipoyldehydrogenase, EC 1.8). 1.4). E2o bildet den Kern des Komplexes mit einer stabilen Stöchiometrie von 24 Kopien in einer kubischen Anordnung, während sich die Proteine ​​E1o und E3 an seiner Peripherie anordnen, um die vollständige Reaktion in einem noch stöchiometrisch und strukturell unbekannten Metabolon höherer Ordnung durchzuführen (Abb. 1A). ). Obwohl einzelne OGDHc-Enzymkomponenten strukturell aufgeklärt wurden und die kinetische Charakterisierung ihrer einzelnen Schritte untersucht wurde (9, 10, 11) (Abb. 1B), ist ihre gegenseitige Kommunikation unbekannt, was daher Struktur-Funktionsstudien, die diesem Metabolon zugrunde liegen, erschwert. Aufgrund der Herausforderung, seine endogene Struktur und Funktion zu untersuchen, wurde kürzlich moderne Massenspektrometrieanalyse in Kombination mit vernetzungsbasierter Modellierung eingesetzt, um Erkenntnisse über die Nähe von Untereinheiten von OGDHc bei niedriger Auflösung abzuleiten, ohne seine Aktivität zu untersuchen12. Dies liegt daran, dass das Metabolon trotz jahrzehntelanger Forschung in vitro noch nicht als funktionelle Einheit wiederhergestellt werden konnte. Darüber hinaus ist die Lipoyldomäne (LD), die Lipoylzwischenprodukte von einem aktiven Zentrum zum nächsten überträgt (E1o → E2o → E3), Teil eines hochflexiblen E2o-Arms, was eine besondere Herausforderung für ihre Untersuchung mit herkömmlichen Strukturmethoden darstellt. Die mögliche Beteiligung zusätzlicher Strukturelemente, wie z. B. Untereinheiten, die zur OGDHc-Kreuzkommunikation beitragen könnten, z. B. KGD413, erschwert die Charakterisierung des Komplexes zusätzlich.

Eine schematische Darstellung des bisherigen Wissens zur OGDHc-Gesamtarchitektur. Ein kubischer Kern bestehend aus 24 E2o-Proteinen mit verlängerten flexiblen Linkern, die in der geordneten LD-Domäne enden, und E1o- und E3-Dimeren an der Peripherie. B Vollständiges Reaktionsschema von OGDHc. C Fluoreszenzlichtmikroskopie isolierter C. thermophilum-Filamente, mit roter Zellmembran, gefärbt mit FM464. D Fluoreszenzlichtmikroskopie eines einzelnen C. thermophilum-Filaments mit roter Zellmembran, gefärbt mit FM464. E Fluoreszenzlichtmikroskopie eines einzelnen C. thermophilum-Filaments, wobei der reichlich vorhandene mitochondriale Inhalt in grüner Farbe sichtbar ist, gefärbt mit MiOr. F Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahme von kryofixierten ultradünnen Abschnitten des C. thermophilum-Filaments. Mit „M“ sind die Mitochondrien im Bild gekennzeichnet. G Vergrößert die in F sichtbaren Mitochondrien-Ultrastrukturen. Die bandförmigen Christae der Mitochondrien von C. thermophilum sind sichtbar (beschriftet als „RLC“).

In dieser Arbeit versuchen wir, die Struktur des OGDHc-Metabolons im Kontext einer nativen Lysatfraktion aufzuklären, die aus Chaetomium thermophilum nach einer einstufigen Fraktionierung von Rohlysat stammt (ergänzende Abbildung 1). C. thermophilum ist ein thermophiler, filamentöser Pilz mit einer optimalen Wachstumstemperatur von 54 °C und die inhärente Thermostabilität seiner Proteine ​​und Proteinkomplexe macht ihn zu einem idealen Modell für Strukturstudien mit Schwerpunkt auf Mehrkomponentenzielen wie OGDHc oder anderen Proteinkomplexen14 ,15,16. Die inhärenten Vorteile eines thermophilen Zellextrakts werden dargelegt, während wir seine Zusammensetzung und Architektur untersuchen. Wir verwenden biochemische Tests, um die kinetischen Parameter des Komplexes für die Produktion von Succinyl-CoA aufzudecken, identifizieren alle seine Komponenten und nutzen Kryo-Elektronenmikroskopie, Vernetzung und künstliche Intelligenz (KI), um die Megastruktur des Komplexes mit hoher Auflösung und strenger Datenerfassung aufzuklären Strategien. Insgesamt liefern wir eine mehrskalige Momentaufnahme eines mit OGDHc angereicherten Zellextrakts, die durch flexible Regionen, die vorübergehende Enzym-Enzym-Wechselwirkungen bestimmen, Enzymclustern, die OGDHc-Zwischenprodukte elektrostatisch kanalisieren, und einer Architektur höherer Ordnung von OGDHc, die für den Gesamtkomplex von entscheidender Bedeutung ist, unterstrichen wird Funktion.

Der thermophile Pilz C. thermophilum wurde 20 Stunden lang bei 54 °C gezüchtet, bevor 8 g Zellfrischgewicht lysiert und durch Größenausschlusschromatographie (SEC) fraktioniert wurden (Methoden). C. thermophilum-Hyphen (Abb. 1C – G) sind reich an Mitochondrien, wie durch konfokale und elektronenmikroskopische Methoden bestätigt wurde (Abb. 1C – G). Mitochondrien weisen die erwarteten lamellenförmigen, bandartigen Cristae auf, die im Querschnitt parallele Stapel bilden17 (Abb. 1F, G). Eine hohe Häufigkeit von Mitochondrien (Abb. 1F, G) steht im Einklang mit der erhöhten Atemfrequenz von Thermophilen18 und motivierte uns, einen an mitochondrialen Aktivitäten angereicherten Zellextrakt abzuleiten, in dem das funktionelle OGDHc in großer Häufigkeit14 mit all seinen bekannten Untereinheiten (E1o) vorliegt , E2o, E3)19. Hier überprüften wir das Vorhandensein aller Enzyme mittels Western Blotting (WB) (Abb. 2A, ergänzende Abb. 2A) und fuhren mit der quantitativen Charakterisierung der kinetischen Parameter für alle löslichen Substrate des Metabolons fort, nämlich NAD+, α-Ketoglutarat (α-KG). ) und Coenzym-A (CoA). OGDHc katalysiert die Umwandlung von α-Ketoglutarat (α-KG) in Succinyl-CoA durch eine mehrstufige Reaktion, an der verschiedene Co-Faktoren beteiligt sind (Abb. 1B): Thiamindiphosphat (ThDP) bindet an E1o, ein kovalent daran gebundenes Lipoat Lipoyl-bindende Domäne (LD) des E2o, wohingegen FAD an die entsprechende Stelle am E3 bindet. E1o und E2o sind für diesen Komplex einzigartig, aber E3 wird von allen Oxosäure-Dehydrogenase-Komplexen gemeinsam genutzt. Die KM-Werte innerhalb der Fraktion wurden bei [149,80 ± 41,78] μΜ, [146,11 ± 46,15] μΜ bzw. [22,81 ± 11,93] μΜ bestimmt (Abb. 2B, ergänzende Abb. 2B, ergänzende Daten 1) und sind mit denen anderer vergleichbar thermophile Gegenstücke20,21. Um den Vorteil eines aktiven Zellextrakts, der von einem thermophilen Eukaryoten stammt, genau darzustellen, haben wir die Charakterisierung wiederholt und einen Vergleich der Reaktionsgeschwindigkeit für α-KG in einem Temperaturgradienten zwischen einem C. thermophilum- und einem S. cerevisiae-äquivalenten Extrakt durchgeführt (Abb . 2C, Ergänzende Daten 1). Die abgeleiteten Daten zeigen deutlich einen Anstieg der Reaktionsgeschwindigkeit für den aus C. thermophilum stammenden Zellextrakt, im Gegensatz zu der Geschwindigkeitsabnahme der Hefeäquivalentprobe, was die Eignung für die Strukturanalyse des aus einem thermophilen Organismus stammenden Zellextrakts zeigt. Nach unserem Kenntnisstand wurde bisher nicht über die Messung kinetischer Parameter für alle OGDHc-Substrate in einer einzelnen endogenen Probe berichtet. Unsere Ergebnisse setzen einen Maßstab für zukünftige Funktionsvergleiche von Ketosäurekomplexen. Unsere Ergebnisse zeigen auch, dass eine einzelne Zellfraktion kinetisch aktiv, aufgrund ihrer biochemischen Natur skalierbar und für die Produktbildung nutzbar ist, ohne dass weitere Reinigungs- oder Anreicherungsschemata erforderlich sind. Wichtig ist, dass ein solcher aktiver Zellextrakt durch Kryo-EM sichtbar gemacht werden kann, um das strukturelle Verständnis des aktiven Komplexes zu vertiefen.

Ein Western-Blot, der den Nachweis aller OGDHc-Komponenten in der nativen Zellextraktfraktion mit dem erwarteten Molekulargewicht (MW) zeigt. Als Negativkontrolle wurde eine Fraktion mit niedrigem Molekulargewicht verwendet, während das überexprimierte Protein, das zur Bildung der Antikörper verwendet wurde, als Positivkontrolle eingesetzt wurde. Aufgrund der großen Größe des E1o-Proteins wurde aus diesem Grund ein Fragment verwendet (siehe Methoden). Entsprechende Bänder wurden mit einem orangefarbenen Pfeil gekennzeichnet. B Enzymatische Charakterisierung des nativen OGDHc. α-Ketoglutarat, NAD+ und CoA wurden entsprechend in den in jedem Diagramm gezeigten Konzentrationen verwendet, die Geschwindigkeit wurde auf 0-1 normalisiert und eine Linie verbindet jeden Punkt, wobei unterschiedliche Symbole die Datenpunkte für die drei unabhängigen biologischen Replikate entsprechend der Anmerkung markieren im Figurenfeld. C-Diagramm, das die Änderung der Reaktionsgeschwindigkeit (nach Normalisierung auf 0-1) in Bezug auf die Temperatur für C. thermophilum im Vergleich zu einer Hefeäquivalentprobe zeigt, wobei unterschiedliche Symbole die Datenpunkte für die drei unabhängigen biologischen Replikate annotieren, wie in der Anmerkung angegeben Figurentafel. Die in den Diagrammen B und C gezeigten KM-Werte wurden mit den in der ergänzenden Abbildung 2B gezeigten Burk-Lineweaver-Diagrammen ermittelt. Der graue Hintergrund für jedes Diagramm und die schwarzen Balken im unteren Diagramm stellen die Standardabweichung dar, die aus N = 3 unabhängigen biologischen Replikaten abgeleitet wurde und 2 technische Duplikate für jedes Replikat. Alle hier angezeigten Werte sind in den Zusatzdaten 1 aufgeführt.

Um das OGDHc-Metabolon strukturell zu charakterisieren, führten wir eine intensive Kryo-EM-Datenerfassung des charakterisierten aktiven Extrakts durch. Die für den E2o-Kern bestimmte Struktur erreichte eine Auflösung von 3,35 Å (ergänzende Abbildung 3A, ergänzende Tabelle 1), was die Erstellung eines De-novo-Modells ermöglichte und die Auflösung gegenüber der des zuvor berichteten E2o-Kerns erheblich verbesserte (ergänzende Abbildung 3B). Die EM-Karte (Abb. 3A) zeigt Strukturmerkmale höherer Ordnung, z. B. inter- und intratrimere Schnittstellen (Abb. 3B), erfasst Sekundärstrukturelemente und platziert Aminosäureseitenketten genau (ergänzende Abb. 3C). Wir konnten das katalytisch aktive Zentrum von E2o identifizieren und die Seitenkettenkonformationen der an der CoA-Bindung beteiligten Aminosäuren, die über Oxosäuredehydrogenasen hinweg konserviert sind, vollständig modellieren. F247 hat eine nach außen gerichtete Ausrichtung, um das CoA aufzunehmen (Abb. 3C) und interagiert und stabilisiert die CoA-3',5'-Adenosindiphosphatgruppe über π-Stapelung. Das begrenzte Vorhandensein der Elektronendichte für die CoA-Komponenten Pantoinsäure, β-Alanin und Cysteamin liegt der inhärenten Flexibilität des endogen gebundenen Coenzyms A zugrunde und hat Auswirkungen auf die Funktion22.

A Die 3,35 Å (0,143 FSC) Kryo-EM-Karte des C. thermophilum OGDHc E2o-Kerns. Maßstabsleiste: 5 nm. B Das rekonstruierte Modell des C. thermophilum E2o-Kerns, eingepasst in die Kryo-EM-Karte. Darunter können die inter- und intratrimeren Grenzflächen isoliert beobachtet werden. C Die CoA-Bindungsregion des E2o mit den annotierten Aminosäureseitenketten, die an seiner Koordination beteiligt sind. Darüber hinaus kann die aufgelöste Dichte in der Tasche einem gebundenen CoA entsprechen. D Aufgelöste Dichte in der Peripherie des E2o-Vertex-Trimers, möglicherweise zugehörig zu einer gebundenen E2o-Lipoyldomäne.

In der Nähe der E2-Lipoylbindungsstelle wird eine weitere Dichte beobachtet, in die die Lipoyldomäne (LD) der E2o-N-ter-Region passen kann (Abb. 3D); Diese Beobachtung steht im Einklang mit zuvor veröffentlichten Daten, wonach im bakteriellen endogenen Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex (PDHc), der ebenfalls einen kubischen Kern bildet – ein Merkmal von Keto-Säure-Komplexen in allen Königreichen –, dem LD23 ebenfalls eine äquivalente Dichte zugeschrieben wurde. Eine gebundene LD wurde auch im aktiven Zentrum von PDHc E2 in einer ähnlichen, stabilen Konformation strukturell verfeinert24. Im hier vorgestellten eukaryotischen, nativen und aktiven OGDHc bleibt diese Dichte bestehen, wenn auch mit geringerer Auflösung, und die LD kann teilweise angepasst werden (Abb. 3D). Ein wesentlicher Unterschied besteht darin, dass das vorliegende eukaryotische OGDHc im Vergleich zu bakteriellem PDHc, das in einem vorgeschlagenen Ruhezustand gefangen sein könnte, in dem alle LDs an die aktiven E2-Zentren gebunden sind, einen alternativen Ruhezustand hervorhebt, in dem LDs unterstöchiometrisch und vorübergehend vorliegen Interaktion mit dem E2-Kern. Insgesamt stellt diese OGDHc-Kernstruktur die Rekonstruktion mit der höchsten Auflösung dar, über die bisher für ein Mitglied der Proteingemeinschaft berichtet wurde, die in nativen Zellextrakten charakterisiert wurde. Neben offensichtlichen hochauflösenden Merkmalen werden die Grenzflächen höherer Ordnung und die aktiven LD/CoA-Zentren mit hoher Auflösung definiert, während aufgrund seiner endogenen Natur niedrig aufgelöste Dichten für das flexibel gebundene CoA und das unterstöchiometrisch gebundene LD auftreten .

Die Rekonstruktion der OGDHc-Dihydrolipoylsuccinyltransferase (E2o) weist hinsichtlich der Gesamtfaltung eine große Ähnlichkeit mit dem beim Menschen überexprimierten, inaktiven Gegenstück auf, jedoch mit lokalisierten Anpassungen (Abb. 4). Der E2o-N-ter in zuvor veröffentlichten Strukturen erhält keine spezifische Faltung (Abb. 4A). Im Gegensatz dazu erhält dieses Element in C. thermophilum eine β-Strang-Konformation (E188-M194), die zusammen mit einem β-Haarnadelmotiv der Reste N266–D282 ein ausgedehntes β-Faltblatt erzeugt (Abb. 4B). Diese Anpassung trägt zur Stabilisierung des Kerns über ausgedehnte Wasserstoffbrückenbindungen bei und beeinflusst die Kommunikation zwischen den Untereinheiten im Zustand höherer Ordnung des 24-meren kubischen E2o-Kerns. Diese Faltung führt zu einer Kondensation des E2o-Kerntrimers im Vergleich zu seinem zuvor veröffentlichten menschlichen Gegenstück, was zu einem geringeren Schwerpunktabstand zwischen den Untereinheiten führt (Abb. 4C, ergänzende Abb. 4A). Nachfolgende energiebasierte Bewertungen der inter- und intratrimeren Schnittstellen von human10 und C. thermophilum (ergänzende Abbildung 4B, C, Methoden) zeigen durchweg höhere Werte für die nativen, thermophilen E2o-Schnittstellen. Wenn man bedenkt, dass die vergrabene Oberfläche proportional zu den experimentell gemessenen Dissoziationskonstanten (KD) biomolekularer Komplexe ist, die keine großen Konformationsänderungen erfahren, deuten unsere Ergebnisse auf eine stärkere Bindung von C. thermophilum E2o-Enzymen hin. In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung sind die Grenzflächen zwischen C. thermophilum und Untereinheiten 1,7- und 1,5-mal größer als die entsprechenden Grenzflächen des menschlichen E2o-Kerns (ergänzende Abbildung 4B, C) und umfassen umfangreiche Ladungs-Ladungs-Wechselwirkungen (ergänzende Abbildung). 4B, C). Eine weitere Folge der oben genannten Verdichtung ist die induzierte Eingrenzung des E2o N-ter LD. Ein antiparalleles β-Faltblatt weist im Vergleich zur zuvor aufgelösten Schleifenkonformation eine größere Stabilität auf26. Antiparallele und gemischte Platten können sowohl Verformungen (Verdrehungen und β-Ausbuchtungen) als auch der Einwirkung von Lösungsmitteln standhalten; Daher kann das neu identifizierte Strukturelement als Ankerpunkt für einschränkende Konformationen dienen, die von der flexiblen Region untersucht werden, die die beiden geordneten E2o-Domänen verbindet, dh die Succinyltransferase, die den E2-Kern bildet, und die LDs, die die Zwischenprodukte tragen.

Ein C. thermophilum E2o-Protein (orange), ausgerichtet an seinem menschlichen Gegenstück (cyan). Zu den auffälligen Unterschieden gehört eine engere Windungskonformation, die zu einer besseren Ausrichtung des β-Haarnadelmodells von C. thermophilum und der β-Strang-Konformation des N-ter von C. thermophilum führt. B Das β-Haarnadelmotiv von N266-D282 bildet zusammen mit dem N-ter-β-Strang E188-M194 ein β-Faltblatt, das zur Gesamtstabilität des Kerns beiträgt. C Schematische Darstellung der Rotationsverschiebung des menschlichen E2o-Vertex-Trimers im Vergleich zum experimentell aufgelösten E2o-Trimer von C. thermophilum, die eine „lockere“ Konformation für das mesophile Gegenstück zeigt.

Während der Katalyse (Abb. 1B) im aktiven OGDHc-Metabolon, den wir eingefangen haben (Abb. 2B), transportiert der flexible E2o-Arm, der die LD hält, das Succinyl-Zwischenprodukt vom E1o zum aktiven E2o-Zentrum und wird durch E327 erneut oxidiert; Daher muss das lipoylierte Lysin der LD ungehinderten Zugang zu jeder Enzymstelle haben. Um diese transienten Schnittstellen strukturell zu charakterisieren, wurde eine AlphaFold-Multimer-Modellierung28 der drei in Metabolon eingebetteten Komponentenschnittstellen (E1o-LD, E2o-LD und E3-LD) durchgeführt. Die für alle drei Komplexe generierten Modelle (Abb. 5A – D, Methoden) sind von hoher Qualität und ihre vorhergesagten Schnittstellen liegen sicher im experimentellen Fehlerbereich (ergänzende Abb. 5A, B). Darüber hinaus ist (a) die durch Kryo-EM abgeleitete Anpassung der LD an die proximale Dichte des E2o-Kerns (Abb. 3D) der von AI in Bezug auf die Positionierung vorhergesagten ähnlich (Abb. 5B) und (b) Der Abstand des lipoylierten Lysins zum Cofaktor oder aktiven Zentrum liegt für alle erzeugten Schnittstellen im Bereich von 10–25 Å (Ergänzende Abbildung 6A – D). Dieser Bereich entspricht der Länge der Lysin-Seitenkette und des Lipoats und spiegelt auch die intrinsische Flexibilität der interagierenden Proteine ​​wider15, die auch in einer aktuellen bakteriellen PDHc-E2o-LD-Schnittstelle beobachtet wurde24. E1o bildet ein Homodimer (Abb. 5A) mit zwei Thiamindiphosphaten (ThDPs) und möglicherweise zwei LD-Bindungsstellen, die an der E1o-Schnittstelle zwischen den Ketten lokalisiert sind (Abb. 5A). Der lipoylierte Lysinabstand zum ThDP-C2-Atom, das während der α-Ketoglutarat-Decarboxylierung succinyliert wird, ist biochemisch machbar (d = 14 Å) (ergänzende Abbildung 6A). E2o bindet ein einzelnes LD pro Monomer (Abb. 5B), und das Lipoyllysin befindet sich in der Nähe des gebundenen CoA, mit einem Lysin-Cα-CoA-Thiolgruppenabstand von ebenfalls d = 10 Å (ergänzende Abb. 6B). Schließlich lokalisiert das aktive E3-Zentrum eine konservierte Disulfidbrücke und ein Histidin in unmittelbarer Nähe, die an der E3-vermittelten LD-Reoxidationsreaktion beteiligt sind29,30,31. Der AI-basierte E3-LD-Komplex zeigt, dass sich das lipoylierte Lysin in angemessener Entfernung befindet, um auf die Disulfidbindung im aktiven E3-Zentrum zuzugreifen (d = 23 Å) (ergänzende Abbildung 6D). Beachten Sie, dass ein zweites, alternatives Konformationsmodell sowohl für E1o-LD- als auch für E3-LD-Komplexe erstellt wurde (ergänzende Abbildung 5B, ergänzende Abbildung 6C, D), das jedoch die oben genannten biochemischen Einschränkungen, die für ein aktives Metabolon wesentlich sind, nicht erfüllte (Abb . 2B).

Ein von der KI abgeleitetes Modell der E1o-LD-Interaktion. Das Gesamtmodell, die Energetik (VdW-Van-der-Waals-Wechselwirkungen, DS-Desolvationsenergie, ES-Elektrostatik) und die vergrabene Oberfläche (BSA) sowie die Gesamtladung seiner Wechselwirkungsschnittstelle mit der LD sind jeweils links, in der Mitte und rechts zu sehen. B KI-abgeleitetes Modell der E2o-LD-Wechselwirkung. Das Gesamtmodell, die Energetik und die vergrabene Oberfläche sowie die Gesamtladung seiner Wechselwirkungsschnittstelle mit dem LD sind jeweils links, in der Mitte und rechts zu sehen. C AI-abgeleitetes Modell der E3-LD-Interaktion. Das Gesamtmodell, die Energetik und die vergrabene Oberfläche sowie die Gesamtladung seiner Wechselwirkungsschnittstelle mit dem LD sind jeweils links, in der Mitte und rechts zu sehen. D AI-abgeleitetes Modell der geordneten LD-Domäne von E2o. Lys42 trägt die Lipoyl-Einheit. Es ist eine stark negativ geladene Wechselwirkungsschnittstelle zu beobachten. Originalwerte für die Darstellung finden Sie in den Zusatzdaten 5.

Die biochemisch (E1o-LD, E2o-LD und E3-LD) und kryo-EM- (E2o-LD) validierten KI-generierten Metabolon-eingebetteten Schnittstellen weisen ein gemeinsames Merkmal auf, das sich zeigt, nachdem sie jeweils einer energiebasierten Verfeinerung unterzogen wurden (Abb . 5A–C): Alle Grenzflächen unterliegen starken elektrostatischen Wechselwirkungen vergleichbarer Größenordnung (Abb. 5A–C), die eine charakteristische energetische Komponente für transiente Grenzflächen mit hohen Ein-/Ausschaltraten darstellen32. Komplementäre Elektrostatik (Abb. 5D) ist ein kollektives Merkmal von Metabolonen, die Zwischenprodukte über einen „Schwingarm“-Mechanismus transportieren33 und andere Stoffwechselprozesse, die ein schnelles Ein- und Ausschalten erfordern34,35. Tatsächlich heben elektrostatische Potentialkarten ausgedehnte positiv geladene Bereiche für die LD-Bindemittel hervor (Abb. 5D). Diese Oberflächen ziehen die negativ geladene Oberfläche des LD an und nehmen sie auf. Insgesamt tragen sie zur strukturellen Verdichtung von Oxosäure-Dehydrogenase-Komplexen bei36, was ein Schlüsselprinzip für die Kanalisierung des Stoffwechsels über den „Schwingarm“-Mechanismus ist37.

Um das breitere Proteom und seine Wechselwirkungen innerhalb des aktiven Extrakts aufzuklären, führten wir auf Massenspektrometrie basierende Vernetzungsexperimente direkt im Extrakt durch (Methoden) und verglichen gleichzeitig die Vernetzungsmittelkonzentrationen (ergänzende Abbildung 7A, B). Insgesamt haben wir mit einem FDR von 2 % auf der Peptidgewinnungsebene (Methoden) 4949 Rest-Rest-Vernetzungen (3632 Intra- und 1317 Inter-Rest-Vernetzungen) ermittelt, von denen 99,4 % auf Polypeptidketten von C. thermophilum abgebildet waren (Ergänzende Daten). 2). Von insgesamt 2091 Polypeptidketten wurden 505 Polypeptidketten über 2 biologische und 2 technische Replikate hinweg vernetzt (Supplementary Data 2). Dies zeigt, dass 29,1 % des gesamten C. thermophilum-Proteoms in Zellgemeinschaften organisiert sind38, die deutlich größer sind als zuvor beschrieben19.

Die Netzwerkanalyse identifizierte 54 Zellgemeinschaften aus verschiedenen Zellkompartimenten (Supplementary Data 2), an denen 1488 identifizierte Mitglieder teilnehmen. Die Abdeckung der Untereinheiten in den Gemeinschaften ist hoch (67 % +/–24 %) und umfasst Beispiele wie den vollständigen zytoplasmatischen (N = 128, 96 % der Untereinheiten) und mitochondrialen (N = 74, 99 % der Untereinheiten) Translationsapparat. Darüber hinaus identifizieren wir alle Untereinheiten der Pyruvatdehydrogenase/Tricarbonsäurezyklus-Gemeinschaft, die miteinander vernetzt sind (PDHc/TCA, N = 25, 100 % der Untereinheiten, Ergänzende Daten 2). Innerhalb der PDHc/TCA-Gemeinschaft definieren Crosslinks Interaktionen innerhalb und zwischen elf teilnehmenden Enzymen (122 Intra- und 169 Interlinks, Supplementary Data 2). Das E3-Protein wies die größte Anzahl an im Experiment identifizierten Intervernetzungen auf (N = 88) und wurde in der Nähe von sieben anderen Gemeinschaftsmitgliedern gefunden (Abb. 6A), was auf seine vielfältige Rolle im mitochondrialen Stoffwechsel hinweist; E3-Proteine ​​erforschen proximale räumliche Positionen mit allen Untereinheiten von PDHc (E1p, E2p, E3BP), OGDHc (E1o, E2o) und einer Untereinheit des hypothetischen mitochondrialen Häm-Metabolons39 und interagieren in letzterem mit einer mutmaßlichen Holocytochrom-c-Synthase (HCC) ( Abb. 6A). Die Sequenzanalyse zeigte jedoch ein fusioniertes, falsch annotiertes ribosomales Protein am HCC-N-ter (ergänzende Abbildung 8), das der schwer fassbaren eukaryotischen KGD4-OGHDc-Untereinheit12,13 entspricht, die E3 an den OGDHc-E2-Kern bindet (Reste M1 – T130). Dieser N-ter weist große Ähnlichkeit mit KGD4 anderer Eukaryoten auf (ergänzende Abbildung 8). Eine erneute Analyse der MS-Daten19 über Zellfraktionen hinweg zeigt eine starke Koelution von KGD4 mit den übrigen OGDHc-Untereinheiten in allen drei biologischen Replikaten (Ergänzungsdaten 2). Da seine Funktion im Wesentlichen die gleiche ist wie die des PDHc-E3BP – die Bindung von E3 an den E2-Kern – haben wir das koeluierende Protein als C. thermophilum-Protein E3BPo bezeichnet.

A-Vernetzungen von E3 offenbaren eine Fülle von Interaktionspartnern. B Die OGDHc-Proteinkomponenten sind stark miteinander verbunden. Blaue Linien stellen die Interprotein-Vernetzungen dar und lila die Intraprotein-Vernetzungen.

In den OGDHc-Komponenten (E1o, E2o, E3, E3BPo) wurden 44 inter- und 81 intramolekulare einzigartige Vernetzungen identifiziert (Abb. 6B); Intramolekulare Vernetzungen bestätigen die E1o-, E2o- und E3-Molekülmodelle weiter (ergänzende Abbildung 9A). Im Detail sind 92,3 %, 90 % bzw. 100 % der zugeordneten Querverbindungen für E1o, E2o und E3 erfüllt. Die Verteilung der Vernetzungsabstände (ergänzende Abbildung 9A, ergänzende Daten 2) rekapituliert die erwartete logarithmische Normalabstandsverteilung40 und bestätigt die Qualität der biochemisch und strukturell validierten KI-abgeleiteten Modelle. Intermolekulare Vernetzungen definieren insgesamt einen relativ kompakten Zustand des OGDHc, da Enzyme, von denen nicht bekannt ist, dass sie physikalische Grenzflächen bilden (E1o/E3; E3BPo/E1o), immer noch in relativer Nähe vorhanden sind (Abb. 6B). Die relative Nähe von E1o und E3 zum E2o-Kern deutet auf die Beteiligung der flexiblen N-ter-Region des E2 hin, die sich stromabwärts von der LD in der Primärsequenz befindet (Abb. 6B). Dieses Ergebnis veranlasste uns, das durch Vernetzung gesteuerte flexible molekulare Andocken der zuvor validierten Interaktionsmodelle des LD mit dem E1o und dem E3 zu nutzen, um vom LD abgetastete Interaktionsoberflächen aufzuklären (Abb. 7A – C).

A Häufigkeitsdiagramme von Resten, die an der Bindungsschnittstelle zwischen LD und E1o (oben) und LD und E3 (unten) beteiligt sind. B Restfrequenzen jedes Rests, der an der Wechselwirkung zwischen der LD (rosa) und dem E1o (grau) beteiligt ist, zeigen eine „leitende“ Schnittstelle (blau) zwischen den beiden, die die LD in Richtung ihrer Bindungstasche (lila) ausrichtet. C-Restfrequenzen aller an der Wechselwirkung zwischen LD (rosa) und E3 (grau) beteiligten Reste zeigen eine „leitende“ Schnittstelle (blau) zwischen den beiden, die die LD in Richtung ihrer Bindungstasche (lila) ausrichtet. Originalwerte für die Darstellung finden Sie in den Zusatzdaten 6.

Wir berechneten die Häufigkeit von E1o- oder E3-Resten, die an der LD-Bindung beteiligt sind, aus den Docking-Ergebnissen (Abb. 7A), nachdem wir unsere Docking-Protokolle angepasst hatten, um die Kartierung von Vernetzungen in ungeordneten Regionen in der Nähe geordneter Domänen in Protein-Protein-Wechselwirkungen zu integrieren (Methoden, 25). Die Kartierung der oberen 25 % der an der LD-Bindung beteiligten Reste aus 400 explizit lösungsmittelverfeinerten Molekülmodellen zeigt eine ausgeprägte Anziehungsfläche für die LD, um schließlich an die jeweiligen aktiven Stellen zu binden (Abb. 7B, C). Reste des aktiven Zentrums werden sowohl für E1o (Abb. 7B) als auch für E3 (Abb. 7C) als häufig kontaktiert identifiziert, aber die anziehende Oberfläche für E1o ist hinsichtlich der wiederhergestellten Hotspots diffuser als die für E3 berechnete (Abb. 7B, C). Diese höhere Signaldiffusion für die LD-Bindung im E1o lässt darauf schließen, dass die proximale Oberfläche das LD in Richtung der E1o-Bindungstasche leiten könnte, da es ziemlich tief vergraben ist (Abb. 7B). Bei E3 hingegen ist die „Leitoberfläche“ viel stärker begrenzt (Abb. 7C) und zwar auf einen schmalen Raum, der sich gleichseitig etwa 5 Å vom flachen aktiven Zentrum von E3 erstreckt. Diese Ergebnisse deuten auf unterschiedliche LD-Anziehungsmechanismen für die peripheren E1o- und E3-Untereinheiten hin, die von flexiblen Regionen gesteuert werden, die stromabwärts von der LD positioniert sind.

Die identifizierten Intravernetzungen bestätigen nicht nur das Vorhandensein der teilnehmenden Proteine ​​und ihrer von der KI abgeleiteten Strukturen (ergänzende Abbildung 9A), sondern bestätigen auch, dass sie multimere Strukturen bilden. Intravernetzungen für E3BPo wurden nicht identifiziert (Abb. 6B), und dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass E3BPo als Monomer an der Bildung des Komplexes beteiligt ist; Pro E3BPo-Kopie ist ein einzelner E3 über seine flexible N-ter-Region an den E2-Kern gebunden13. Die Umwandlung der iBAQ-Ergebnisse in qualitative stöchiometrische Daten, wie sie zuvor für PDHc14 durchgeführt wurde, deutet auf eine exakte Stöchiometrie von 24 E2o-Untereinheiten hin, validiert durch Kryo-EM; und relative Stöchiometrien von <10 E1o-Dimeren und ~4 E3BPo, die insgesamt 4 E3-Dimere anbinden (ergänzende Abbildung 9B, C). Da sich E3 auch in der Nähe der gestörten E2o-Regionen und seiner proximalen E2o-LD-Domäne befindet, ist es gut möglich, dass mehr E3 untergebracht werden können. Wenn man jedoch bedenkt, dass der E2-Kern bis zu 48 Moleküle rekrutieren kann, was einem Metabolon von 96 Polypeptidketten entspricht (24 E2o- und maximal 24 E3BPo-Monomere, die jeweils 12 E1o- und 12 E3-Dimere anbinden), zeigen relative Stöchiometrien die substöchiometrische Zusammensetzung der Peripherie OGDHc-Untereinheiten. Dies deutet auf das Vorhandensein ungebundener flexibler N-ter-E2o-Kernregionen hin, die am LD-Handel beteiligt sind.

Um die Architektur höherer Ordnung des OGDHc innerhalb des Extrakts aufzuklären, führten wir asymmetrische Rekonstruktionen aus den Einzelpartikeldaten durch, was zu 2D-Projektionen führte, bei denen äußere Dichten sichtbar waren (Abb. 8A). In diesen externen Dichten sollten sich die identifizierten E1o- und E3-Dimere befinden, die jeweils entweder über die flexiblen Regionen des N-Terminus von E2o (Abb. 6B) oder, im Fall von E3, über das flexible E3BPo (Abb. 6B) angebunden sind ,13). Die Kryo-EM-Karte (Abb. 8B) wurde mit einer Auflösung von 21 Å bestimmt (Ergänzungsabbildung 3B, Ergänzungstabelle 1) und zeigte Dichten um den E2o-Kern herum, geclustert und nicht diffus (Abb. 8B). Zunehmende Dichteschwellen der Kryo-EM-Karte zeigten zusätzliche, schwächere Dichten (Abb. 8B). Die systematische Anpassung der von AlphaFold2 abgeleiteten E1o-LD- und E3-LD-Modelle von C. thermophilum (Abb. 8B, ergänzende Abb. 10A, B, ergänzende Daten 3) in die Kryo-EM-Karte löste die Lokalisierung dieser Moleküle und legt nahe, dass sie vorhanden sind in der Peripherie und nicht auf oder innerhalb der Kerndichten. Darüber hinaus wurden persistente Docking-Lösungen berechnet, die die Positionen von E1o und E3 in der Karte rekapitulierten, aus den systematisch angepassten Strukturmodellen, die mit hohen Kreuzkorrelationswerten verbunden sind (Ergänzungsdaten 3, ergänzende Abb. 10A, B): Insgesamt 2 E1o und Innerhalb der berechneten externen Dichten konnten 3 E3-Dimere aufgelöst werden.

Ein 2D-Klassendurchschnitt des OGDHc zeigt einen Kern mit hohem Signal, umgeben von einem diffuseren, aber immer noch gut definierten Signal an der Peripherie. Maßstabsleiste: 5 nm. B Die asymmetrische 3D-Rekonstruktion des OGDHc zeigt eine starke Dichte entsprechend dem E2o-Kern und eine Mischung aus schwächeren und stärkeren externen Dichten. In den höheren Dichten können E1o- und E3-Dimere mit hoher Sicherheit lokalisiert werden. Maßstabsleiste: 10 nm.

Während die angebundenen E1o- und E3-Enzyme in der Nähe des E2o-Kerns asymmetrisch verteilt sind, behalten sie ungefähr gleiche Abstände vom Kern selbst bei (Abb. 8B). Die inhärente Flexibilität der Anbindungsregion in OGDHc ist nicht mit physikalisch-chemischen oder statistischen Berechnungen für flexible Proteinregionen verschiedener Kategorien vereinbar (z. B. IDPs, geschmolzene Kügelchen, vollständig ausgedehnt; ergänzende Abbildung 10C). Gemäß der in unserer abgeleiteten 3D-Rekonstruktion gemessenen E2o-Linkerlänge (Abb. 9A, ergänzende Abb. 10C) weisen die flexiblen OGDHc-Regionen Eigenschaften auf, die zwischen den berechneten Längen von „gestreckten“ IDPs (IDPs gemäß Definition in Marsh und Forman-Kay41) liegen „eingeschränkte“ Linker (wie von George und Heringa42 definiert). Um zu klären, ob die gemessenen Abstände zwischen geordneten OGDHc-beteiligten Enzymen, die durch flexible Regionen vermittelt werden, in den verfügbaren Strukturdaten rekapituliert werden können, haben wir den Abstand von Aminosäureresten berechnet, die aufgelöst, aber sequenzmäßig aufgrund einer unaufgelösten Strecke in der Sequenz weiter voneinander entfernt sind Strukturdaten. Während verschiedene technische Gründe für das Vorhandensein dieser ungelösten Strecke verantwortlich sein können, kann sie auch ein Indikator für eine strukturelle Störung sein43. Durch die Analyse aller Strukturdaten der Proteindatenbank (PDB)44 mit Stand Juni 2022 (191.144 Strukturen) zeigen die Ergebnisse dramatisch begrenzte Abstände zwischen den geordneten Resten vor und nach dem „fehlenden“ Abschnitt (Abb. 9A). Dies bedeutet, dass aktuelle Strukturdaten in der PDB sehr selten Wechselwirkungen der in unseren Ergebnissen berichteten Art enthalten (Abb. 8B, Abb. 9A). Eine relative „Abflachung“ der berechneten Abstände für fehlende Polypeptidabschnitte mit mehr als 25 Aminosäureresten ist offensichtlich (Abb. 9A), und die angegebenen maximalen Ca-Ca-Abstände liegen im Durchschnitt bei ~30 Å, was wesentlich kürzer ist als die im OGDHc-Metabolon .

Ein Diagramm, das die mittleren Abstandswerte der gruppierten Gruppen aller unaufgelösten Aminosäuresequenzen darstellt, die zu allen in der PDB hinterlegten Proteinstrukturen gehören. Schwarze Punkte stellen den Mittelwert einer Längengruppe von Aminosäuren dar, wobei unterschiedliche Grauskalen die Standardabweichung nach der Integration jedes Quartils der Gesamtdaten darstellen, wie in der Diagrammlegende angegeben. Die rote Linie stellt ein angepasstes Modell dar, das die Beziehung zwischen dem Abstand und der Länge von Aminosäuregruppen beschreibt. Hellgrün ist der experimentell gemessene durchschnittliche Abstand zwischen dem N-ter der aufgelösten Kerndomäne des E2o und dem C-ter des LD, der an ein angepasstes E1o-Dimer an der Peripherie gebunden ist, während dunkelgrün den gleichen experimentell gemessenen durchschnittlichen Abstand darstellt gemessen zwischen dem N-ter der aufgelösten Kerndomäne des E2o und dem C-ter des LD, das an ein angepasstes E3-Dimer gebunden ist. Die blaue Linie stellt den theoretischen Abstand einer Aminosäuresequenz dar, während die gestrichelte blaue Linie die theoretische Untergrenze einer beliebigen Aminosäuresequenz darstellt. B Schematische Darstellung der peripheren Untereinheitsorganisation des aufgelösten OGDHc. C-Modell, das alle neuartigen Beobachtungen zur Organisation des OGDHc beschreibt. Die N-ter-β-Faltblatt-Konformation des E2o-Kern-Vertex-Trimers hilft, den 24-mer-E2o-Kern zu stabilisieren und zu verdichten und gleichzeitig den flexiblen Linker auszurichten, der die LD-Domäne verbindet. Die Vernetzungsdaten zeigen eine ziemlich stabile Wechselwirkung zwischen dem flexiblen Linker und den peripheren Untereinheiten, was möglicherweise auf eine strukturelle Rolle einer unbeladenen LD-Domäne hindeutet, während eine andere, beladene LD-Domäne den Reaktionszyklus durchführt. Die Wechselwirkung zwischen der LD und den peripheren Untereinheiten wird durch starke elektrostatische Kräfte bestimmt.

Unsere kombinierten Ergebnisse erweitern unser Verständnis der vorgeschlagenen Architektur des Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplexes im Kontext eines Succinyl-CoA-produzierenden Zellextrakts (Abb. 9B, C). Der Kern des Komplexes ist eine robuste kubische Ultrastruktur, in der die E2o-Trimere, aus denen die Eckpunkte bestehen, mithilfe von Sekundärstrukturelementen mit mehreren Untereinheiten (N-ter-β-Faltblatt der Kerndomäne) dicht gepackt sind. Diese dichte Kernpackung könnte entweder eine thermophile Anpassung sein, wie zuvor im Fall des verwandten Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes gezeigt, oder ein allgemeines Merkmal der endogenen OGDHc. Obwohl OGDHc als ähnlich zu PDHc angesehen wird, sind die endogenen E2-N-ter-Konformationen unterschiedlich: In OGDHc ist der E2-N-ter in einer β-Strang-Konformation gefaltet, Teil eines β-Faltblatts zwischen den Ketten; in endogener PDHc ist dieses N-ter-Element flexibel. Solche strukturellen Anpassungen erweitern unsere Sicht auf mögliche Spezifitätsdeterminanten für die Bindung deutlich geladener LDs an verschiedene E2-Kerne in Oxosäuredehydrogenasen.

Eine weitere Beobachtung, die wir abgeleitet haben, ist, dass dasselbe Strukturelement den verfügbaren Raum der erweiterten flexiblen N-ter-Linker einschränkt, die die LD-Domäne binden, die die entscheidende Domäne für den Transport der Substrate über aufeinanderfolgende aktive Zentren ist, die an der Reaktion beteiligt sind etwa 50–100 Å für die LD-E1o-Wechselwirkung und 60–70 Å für die LD-E3-Wechselwirkung. Bemerkenswert ist auch, dass die elektrostatische Komplementarität die Bindung des LD an seine verschiedenen Bindemittel (E1o, E2o, E3) vorantreibt. Der flexible Linker und die LD von E2o können, basierend auf unseren XL-MS-Daten, auch als „Anker“ fungieren, der in Abwesenheit spezifischer peripherer Untereinheit-Bindungsdomänen in der E2o-N-ter-Sequenz die E1o- und E3-Untereinheiten beibehält Nähe zum E2o-Kern. Kürzlich wurde festgestellt, dass die ungeordnete N-ter-Domäne von E1o mit der E1o-LD-Bindungsstelle45 interagiert und die Organisation von E1o in der Nähe des E2o-Kerns möglicherweise weiter unterstützt, indem sie mit anderen LD-Bindungsschnittstellen im Metabolon interagiert. Sowohl E1o als auch E3 enthalten als Homodimere zwei LD-Bindungsstellen, was darauf hindeutet, dass eine eine aktive Rolle in der Reaktion spielt, während die andere eine hoch geladene komplementäre elektrostatische Bindung mit einer proximalen „entladenen“ LD-Domäne aufrechterhalten kann. Diese „entladene“ LD-Domäne kann als „Anker“ fungieren, möglicherweise auch unterstützt durch andere schwächere Wechselwirkungen des flexiblen Linkers mit Oberflächenresten der peripheren Untereinheiten sowie dem identifizierten E3BPo-Protein, das ebenfalls in unseren XL-MS-Daten zur Organisation erfasst wurde das E3-Protein. Die „strukturelle“ Rolle der zusätzlichen LD-Domänen kann auch durch die substöchiometrische Beziehung zwischen den Kern-E2o- und den peripheren E1o-E3-E3BPo-Untereinheiten angedeutet werden, wie durch die hier präsentierten MS-Daten quantifiziert. Die Kombination molekularbiologischer Methoden zur Überexpression von E1o-, E3- und E3BPo-Untereinheiten und die Durchführung von Mischungsexperimenten mit der OGDHc-haltigen Zellextraktfraktion würden möglicherweise tiefere Einblicke in das Zusammenspiel von Stöchiometrie, Wechselwirkungen und Anpassungen der molekularen Struktur des Metabolons ermöglichen. Diese Arbeit, unterstützt durch quantitative Proteomik mit markierten Peptiden zur genauen Bestimmung der Stöchiometrien im Extrakt und damit der Konzentrationen, würde wichtiges Material zum Verständnis der OGDHc-Funktion mit Kryo-EM liefern.

Insgesamt haben wir in dieser Arbeit den gesamten Inhalt eines Zellextrakts mit der Fähigkeit zur Succinyl-CoA-Produktion charakterisiert und die biochemische Funktion und neuartige Strukturmerkmale des Hauptakteurs der Reaktion, des OGDHc und seiner Komponenten E1o, E2o, E3, E3BPo, aufgeklärt . Unsere Arbeit wirft Fragen auf, die angegangen werden müssen: Gibt es ein interfraktionelles Zusammenspiel zwischen den verschiedenen vorhandenen Proteingemeinschaften? Wie lassen sich ihre biochemischen und strukturellen Zusammenhänge charakterisieren? Diese Fragen können nur durch den Einsatz automatisierter Hochdurchsatz-Kryo-EM eines vollständig vernetzten Zellextrakts mit hoher Dichte in Kombination mit einer umfangreicheren Datenerfassung beantwortet werden, um die Probleme der komplexen Flexibilität und der relativ geringen Häufigkeit einzelner Elemente anzugehen . Fortschritte in der Instrumentierung46, Datenerfassung47 und Analyse48,49 sowie die Einführung präziser KI-gesteuerter Modellierung50 werden eine Straffung der Charakterisierung nativer Zellextrakte ermöglichen. Es ist möglich, dass unser Ansatz in naher Zukunft zu neuen Paradigmen der enzymatischen Analyse im Zusammenhang mit anderen zellulären Metabolonen führen wird, die noch schwer fassbar sind.

Chaetomium thermophilum var. thermophilum La Touche 1950 (Thermochaetoides thermophila51) wurde vom DSMZ (Leibniz-Institut DSMZ – Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Deutschland) erworben und die in gefriergetrockneten Ampullen konservierten Sporen wurden gemäß den Unternehmensrichtlinien (DSMZ-Medienliste Medium 188) kultiviert , Temperatur: 45 °C). Nach der anfänglichen Kultivierung wurde das Myzel in flüssigen Komplettkulturmedien (CCM) vermehrt, die pro 1.000 ml ddH2O Folgendes enthielten: 5,00 g Trypton, 1,00 g Pepton, 1,00 g Hefeextrakt, 15,00 g Dextrin, 3,00 g Saccharose, 0,50 g MgSO4 × 7 H2O, 0,50 g NaCl, 0,65 g K2HPO4 × 3 H2O und 0,01 g Fe2(SO4)3 × H2O. Der endgültige pH-Wert des CCM wurde auf 7,1 eingestellt. Die endgültigen Kulturen wurden wie folgt durchgeführt: Plattenkulturen mit festen Medien: flüssiges CCM wurde mit 15,00 g Agar/1000 ml ddH2O ergänzt und die Platten wurden dann mit Myzel beimpft und bei 54 °C gezüchtet. Flüssigmedienkulturen: 2000-ml-Erlenmeyerkolben wurden zu 40 % des Gesamtvolumens (800 ml) mit flüssigem CCM-Medium gefüllt, kleine Stücke frisch gewachsenes Myzel von Agarplatten wurden hinzugefügt und dann unter Schütteln bei 110 U/min und 10 % CO2 für 20 Minuten inkubiert H.

Die fluoreszenzmikroskopische Bildgebung wurde wie folgt durchgeführt: Ein Zeiss LSM880 (Carl Zeiss, Deutschland) mit einem 40X-Objektiv ohne Immersion (Plan-Apochromat 40X/0,95 NA) wurde zur Abbildung der Proben verwendet und die Bilder wurden mit der Bildanalysesoftware ZEN Black aufgenommen (Carl Zeiss, Deutschland). Zur Membranfärbung mit FM 4-64 (ThermoFisher Scientific, USA) wurde der Farbstoff in DMSO auf eine Stammkonzentration von 10 mM verdünnt; Anschließend wurde 1 μl Stammlösung zu 1 ml flüssiger C. thermophilum-Zellkultur gegeben, wodurch eine Arbeitskonzentration von 10 μM erreicht wurde. Die Proben wurden nach 2–3 m Inkubationszeit abgebildet. Für die Mitochondrienfärbung mit MitoTracker Orange (ThermoFisher Scientific, USA) wurde der Farbstoff in DMSO auf eine Stammkonzentration von 10 μM verdünnt; Anschließend wurden 5 μl Stammlösung zu 1 ml flüssiger C. thermophilum-Zellkultur gegeben, wodurch eine Arbeitskonzentration von 50 nM erreicht wurde. Die Proben wurden nach 10 m Inkubationszeit abgebildet. Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bildgebung wurde wie folgt durchgeführt: Frisch vermehrte Flüssigkultur-C. thermophilum-Filamente wurden mit 3 % Glutaraldehyd (Sigma, Taufkirchen, Deutschland) in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer (SCP; pH 7,2) fünf Stunden lang bei Raum fixiert Temperatur. Nach der Fixierung wurden die Proben in SCP gespült und mit 1 % Osmiumtetroxid (Roth, Karlsruhe, Deutschland) eine Stunde lang bei Raumtemperatur in SCP nachfixiert. Anschließend wurden die Proben mit Wasser gespült, in einer abgestuften Ethanolreihe dehydriert, mit Epoxidharz nach Spurr (1969)52 infiltriert, 24 Stunden bei 70 °C polymerisiert und dann mit einem Ultracut S-Ultramikrotom in 70 nm ultradünne Schnitte geschnitten (Leica, Deutschland). Nach dem Schneiden wurden die Schnitte auf Kupfergitter mit Formvar-Beschichtung aufgetragen und zur Nachfärbung in einem speziellen EM-Färbegerät (Leica, Deutschland) mit Uranylacetat und Bleicitrat versetzt. Für die Bildgebung wurde ein Zeiss EM 900 TEM (Carl Zeiss, Deutschland) mit 80 keV verwendet. Die gesamte Bildverarbeitung wurde mit der Fiji-Software53 durchgeführt.

Zur Herstellung des Zellextrakts wurde sorgfältig gewachsenes Myzel15 mithilfe eines Siebs mit einer Porengröße von 180 μm isoliert und anschließend dreimal mit PBS bei 3000 × g, 4 Minuten und 4 ° C gewaschen. Nach dem Entfernen jeglicher Restfeuchtigkeit wurde das Pellet mit einem vorgekühlten flüssigen N2-Mörser gefriergemahlen und für die spätere Verwendung bei –80 °C gelagert. Ungefähr 8 g des gefriergemahlenen Materials wurden in 20 ml Lysepuffer (100 mM HEPES pH 7,4, 5 mM KCl, 95 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5 % Glycerin, 0,5 mM EDTA, Pefabloc 2,5) lysiert mM, Bestatin 130 μM, 10 μg mL–1 DNAse, E-64 40 μM, Aprotinin 0,5 μM, Pepstatin A 60 μM, Leupeptin 1 μM), mit 3 Wiederholungen von 6,5 mps Schüttelgeschwindigkeit für 25 s, 4 °C in a Fastprep-Zellhomogenisator und 3 Minuten Ruhe in Eis nach jeder Wiederholung. Ein Zentrifugationsschritt bei 4000 × g wurde verwendet, um die größeren Zelltrümmer zu pelletieren, und anschließend wurde eine Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 100.000 × g durchgeführt. Der resultierende Überstand wurde durch einen 100-KDa-Cutoff-Zentrifugenfilter filtriert und auf 30 mg·mL-1 konzentriert.

Der filtrierte, auf 30 mg·ml-1 konzentrierte Überstand wurde auf eine Größenausschlusssäule Biosep SEC-S4000 aufgetragen, die über eine 500-μL-Schleife an ein ÄKTA Pure 25 M FPLC-System (Cytiva, USA) montiert ist. Die Säule wurde vor der Probenaufgabe mit einem filtrierten, entgasten Puffer mit 200 mM CH3COO−NH4+ bei pH 7,4 äquilibriert. Das Fraktionsvolumen wurde auf 250 μl und die Flussrate auf 0,15 ml·min−1 eingestellt. Basierend auf erfassten MS-Daten (siehe Details unten) wurde Fraktion 6 ausgewählt, um auf ihre Eignung als Succinyl-CoA-produzierender Zellextrakt getestet zu werden.

Um eine äquivalente Hefeprobe für den Vergleich der enzymatischen Aktivität herzustellen, wurde der Stamm Saccharomyces cerevisiae von ATCC (American Type Culture Collection PO Box 1549 Manassas, VA 20108 USA; ATCC® 24657TM) 5 Stunden lang in YPDG-Medium bei 30 °C kultiviert. auf eine OD595 von 2,5 (frühe exponentielle Phase), dann bei 3000 × g für 5 Minuten bei 4 °C geerntet und mit destilliertem Wasser gewaschen (resultierendes Pellet ~7 g). Das anschließende Protokoll bis zur endgültigen Probenvorbereitung ist identisch mit der oben beschriebenen C. thermophilum-Vorbereitung.

Der OGDH-Aktivitätstest wurde von54 angepasst. Der Enzymtest wurde in einem Reaktionsvolumen von 100 µL bei 4 °C hergestellt und enthielt 100 mM NaCl, 30 mM K2HPO4 (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 2 mM ThDP, 4 mM α-Ketoglutarat, 3 mM NAD+, 0,4 mM CoA und 4 µL Zellzählkit 8 und 2 µL Zelllysat mit OGDH. Für KM-Berechnungen wurde α-Ketoglutarat von 50 bis 5000 µM, NAD+ von 25 bis 5000 µM und CoA von 5 bis 1000 µM titriert. Das Reaktionsgemisch (ohne α-Ketoglutarat) wurde für die Substrat-KM-Berechnungen 5 Minuten lang bei 37 °C und für die temperaturabhängige kinetische Charakterisierung bei 25 °C bis 65 °C mit 5 °C-Intervallen vorinkubiert und die Reaktion gestartet durch die Zugabe von α-Ketoglutarat. Die Formazanproduktbildung durch WST-8 des Zellzählkits 8 wurde jede Minute 1 Stunde lang bei 460 nm überwacht und die Konzentration mit der Lambert-Beer-Gleichung und dem molaren Absorptionskoeffizienten von WST-855 (ε = 3,07 × 104 M) berechnet −1 cm−1). Aufgrund der Substratüberschusshemmung wurden die Reaktionsgeschwindigkeiten gegen die Substratkonzentrationen unter Verwendung des doppelten reziproken Lineweaver-Burk-Diagramms56 aufgetragen und die KM-Werte am Abszissenschnittpunkt der asymptotischen linearen Regression bestimmt.

Für Western Blotting (WB)-Experimente wurden selbst gegossene, frisch hergestellte 1 mm dicke Gele mit der folgenden Zusammensetzung verwendet: Trennphase: 370 mM Tris-HCl pH 8,8, 10 % w/v Acrylamid (37,5:1), 0,04 % w/v APS, 0,002 % v/v TEMED, 0,1 % w/v Natriumdodecylsulfat (SDS) in ddH2O, Stapelphase: 125 mM Tris-HCl pH 6,8, 5 % w/v Acrylamid (37,5:1) , 0,04 % w/v APS, 0,002 % v/v TEMED, 0,1 % w/v SDS in ddH2O. Die Proben wurden zuvor mit einem 4-fach geladenen Farbstoff (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 40 % v/v Glycerin, 20 % v/v β-Mercaptoethanol, 0,2 % w/v Bromphenolblau, 8 % w/v SDS) gemischt und Anschließend 5 Minuten bei 100 °C inkubieren. Für jede native Probe wurden etwa 400 ng Protein in jede Spur geladen und 5 μl Precision Plus Protein™ All Blue Prestained Protein Standards (Biorad, USA) wurden als Marker in jedes Gel geladen. Die Konzentration der rekombinanten Kontrollproben betrug etwa 8 ng. Nach der Beladung folgte eine Gelelektrophorese in einem 1X-Elektrophoresepuffer, frisch verdünnt aus einer 10X-Stammlösung (144 g Glycin, 30,3 g Tris-Base in ddH2O), mit einem angelegten elektrischen Feld von 100 V für 1,5 Stunden. Ein Trans-Blot® Turbo Transfer System (Biorad, USA) wurde verwendet, um den Gelinhalt 20 Minuten lang mit einem voreingestellten angelegten Feld von 25 V (1 A) auf eine Nitrozellulosemembran zu übertragen. Die Blockierung erfolgte 1 Stunde lang unter ständigem Rühren in 5 % w/v TBST/Milch-Lösung und dann wurden die Membranen 16 Stunden lang bei 4 °C mit dem primären Antikörper inkubiert (alle angewendeten Antikörperkonzentrationen wurden auf 0,2 μg·ml eingestellt). 1, 2 % w/v TBST/Milch). Der primäre Antikörper wurde entfernt und es folgten drei Waschschritte mit 2 % w/v TBST/Milch. Die Membran wurde dann mit dem Sekundärantikörper (Goat Anti-Rabbit IgG, Abcam, ab205718, 0,1 μg·mL−1, 2 % w/v TBST/Milch) 1 Stunde lang inkubiert. Es wurden drei weitere Waschschritte mit 2 % w/v TBST/Milch durchgeführt und schließlich wurden die Membranen mit einem ChemiDoc MP Imaging-System (Biorad, USA) und einer frisch gemischten ECL-Fluoreszenzmischung und optimalen Belichtungszeiten gescreent. Alle Primärantikörper wurden von GenScript (New Jersey, USA) maßgeschneidert und die zur Erzeugung der Antikörper verwendeten Antigensequenzen werden hier beschrieben: (a) Das E1o α/β-Protein weist eine rekombinante Sequenz auf, die Met-E1o611-818-His6 umfasst, und a Molekulargewicht (MW) von 24.014,67 Da; (b) Das E2o-Protein hat eine rekombinante Sequenz, die Met-E2o39-420-His6 und ein MW von 42.485,91 Da umfasst; und (c) das E3-α/β-Protein weist eine rekombinante Sequenz auf, die Met-E335-504-His6 und ein Molekulargewicht von 51.341,91 Da umfasst.

Zur strukturellen Charakterisierung des Succinyl-CoA-produzierenden Zellextrakts wurde eine 3,5-μl-Probe mit einer Endproteinkonzentration von 0,3 mg·mL−1 auf einen kohlenstoffbeschichteten, löchrigen Trägerfilm vom Typ R2/1 auf einem 200-Mesh-Kupfergitter (Quantifoil, Deutschland), das zuvor unter folgenden Bedingungen glimmentladen wurde: 15 mA, Gitter negativ, 0,4 mbar und 25 s Leuchtdauer mit einem PELCO easiGlow (TED PELLA, USA). Das Gitter wurde dann mit einem Vitrobot® Mark IV-System (ThermoFisher Scientific, USA) tauchgefroren, nachdem es mit Vitrobot®-Filterpapier (aschefreies Filterpapier der Güteklasse 595, ø55/20 mm) abgetupft worden war. In der Kammer wurden die Bedingungen bei 4 °C und 95 % Luftfeuchtigkeit stabilisiert, während die Blot-Parameter auf 0 Blot-Kraft und 6 s Blot-Zeit eingestellt waren. Das verglaste Gitter wurde beschnitten und unter Kryo- und niedrigen Luftfeuchtigkeitsbedingungen auf ein Glacios 200 keV Kryo-Transmissionselektronenmikroskop (ThermoFisher Scientific, USA) geladen. Die Bilder wurden mit dem Direktelektronendetektor Falcon 3EC und der EPU-Software (ThermoFisher Scientific, USA) im linearen Modus und einer Gesamtelektronendosis von 30 e−/Å2 aufgenommen. Vor der Aufnahme wurde der Strahl parallel und senkrecht zur Probe mit einem Durchmesser von 2,5 μm ausgerichtet, während eine Objektivapertur von 100 μm den Objektivwinkel einschränkte. Die vollständigen Erfassungsparameter sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Alle Schritte der Bildverarbeitung wurden mit der Hochleistungsrechnersoftware cryoSPARC Version 3.3.157 durchgeführt. Ein Datensatz mit 25.803 Filmen wurde in einen speziellen Arbeitsbereich importiert. Die in der Software enthaltenen Algorithmen zur Patch-Bewegungskorrektur (Multi) und Patch-CTF-Schätzung (Multi) wurden verwendet, um die strahlinduzierte Bewegung zu korrigieren und die CTF-Parameter der Mikroaufnahmen zu berechnen. Nach der Kuratierung des Datensatzes wurden 24.300 mikroskopische Aufnahmen für die nachfolgenden Schritte des Bildanalyseprozesses ausgewählt. Vorlagen wurden aus EMD-1384416 mit dem Auftrag „Vorlagen erstellen“ erstellt (20 generierte Vorlagen mit gleichen Abständen) und für einen Auswahlauftrag mit dem Vorlagenwähler verwendet, was zu einem anfänglichen Datensatz von 3.596.302 Partikeln führte, der mit einer Boxgröße von 208 Pixeln extrahiert wurde . und dann referenzfrei 2D klassifiziert in 200 Klassen. Aus der anfänglichen 2D-Klassifizierung wurden 71.912 Partikel aus 4 Klassen ausgewählt und einer heterogenen Verfeinerung unterzogen, wodurch der endgültige Partikelsatz weiter auf 52.034 Partikel verfeinert wurde, nachdem Partikel verworfen wurden, die zu fehlerhaften OGDHc-E2o-Kernstrukturen führten. Der endgültige Partikelsatz wurde dann um die oktaedrische (O) Symmetrie erweitert und für die endgültige Kernrekonstruktion mit der lokalen Verfeinerung (neu) verwendet, was zu einer OGDHc-E2o-Kernkarte mit einer Auflösung von 3,35 Å führte (Goldstandard-FSC-Kriterium 0,143) ( Ergänzende Abbildung 3A). Für die Rekonstruktion des gesamten OGDH-Komplexes wurden die 71.912 Partikel, die in der Kernrekonstruktion enthalten waren, mit einer größeren Boxgröße von 288 Pixeln erneut extrahiert, um Signale für die Untereinheiten einzubeziehen, die sich in der Peripherie des Kerns befinden. Anschließend wurden sie in 20 2D-Klassen neu klassifiziert und die Klassen, die die auffälligsten peripheren Dichten aufwiesen, wurden erneut als Vorlage für eine neue Runde der Vorlagenauswahl verwendet, was zu einem anfänglichen Partikelsatz von 2.891.518 einzelnen Partikeln führte. Dieser Partikelsatz durchlief drei weitere Runden der 2D-Klassifizierung, wobei immer Klassendurchschnitte ausgewählt wurden, die ein robustes Kernsignal zeigten, aber zusätzlich zum Kern auch ein Signal der peripheren Untereinheit aufwiesen, was zu einem Satz von 52.551 Partikeln führte, die schließlich für eine 3D-Klassifizierung verwendet wurden Job mit 10 Klassen. Klasse 0, die 5178 Partikel enthält und die am besten aufgelösten peripheren Dichten aufweist, wurde schließlich zur homogenen Verfeinerung verwendet, was zu einer OGDHc-Karte mit einer Auflösung von 21,04 Å (Goldstandard-FSC-Kriterium 0,143) führte (ergänzende Abbildung 9D), die dann verwendet wurde für alle Strukturanalysen. Die gesamte Kartenvisualisierung wurde mit dem ChimeraX58-Softwarepaket durchgeführt.

Zur Verfeinerung der E2o-Kernstruktur wurde das ursprüngliche Modell (PDB-ID: 7Q5Q) mit ChimeraX in die Kryo-EM-Dichte eingepasst und dann mithilfe einer iterativen manuellen Verfeinerung mit Coot59 und einer Realraumverfeinerung mit Phenix60 mit Standardparametern verfeinert. Die kartierbare sichtbare Dichte wurde in Richtung N-ter des E2o, von M195 bis E188, erweitert.

Eine lokale Installation von AlphaFold-Multimer28 wurde verwendet, um Vorhersagen über das E2o-Kernscheitelpunkttrimer zu treffen, das in der experimentell abgeleiteten Karte modelliert wurde, das E1o-Dimer (Uniprot-ID: G0RZ09) und das E3-Dimer (Uniprot-ID: G0SB20) im Komplex mit die Uniprot-annotierte E2o-LD-Domäne (Restnummern 40–115, Uniprot-ID: G0SAX9). Alle auf AlphaFold2 basierenden Qualitätsmetriken (Predicted Alignment Error (PAE) und Predicted Local Distance Difference Test (plDDT) sind in der ergänzenden Abbildung 5A, B zu finden. Um alle elektrostatischen Oberflächen zu berechnen und zu visualisieren, wurde das APBS-Elektrostatik-Plugin61 verwendet PyMol (Schrödinger, USA).

Für die gemeldeten HADDOCK2.2-Berechnungen wurden zwei unterschiedliche Protokolle angewendet: (a) HADDOCK-Verfeinerung62. Hier wurde das Verfeinerungsprotokoll angewendet, um die Energetik von Schnittstellen zwischen OGDHc-Komponenten und seinem menschlichen Homologen sowie den von der LD gebildeten AlphaFold2-generierten Schnittstellen zu berechnen und zu vergleichen. Bei diesem Verfeinerungsverfahren wurde nur die Wasserverfeinerungsstufe des HADDOCK-Protokolls durchgeführt, die eine qualitative Korrelation der berechneten Energetik mit Bindungsaffinitäten für vorübergehende Protein-Protein-Wechselwirkungen25 zeigte, wobei der Docking-Schritt übersprungen wurde. Hierzu wurden die Komplexe in einer 8 Å-Hülle aus TIP3P-Wasser solvatisiert. Das Protokoll bestand aus den folgenden Schritten: (1) 40 EM-Schritte mit fixiertem Protein (Powell-Minimierer) und (2) 2 × 40 EM-Schritte mit harmonischen Positionsbeschränkungen für das Protein (k = 20 kcal·mol−1 Å−2). ). Für die abschließende Wasserveredelung wird nach Schritt (2) ein sanftes simuliertes Glühprotokoll unter Verwendung der Molekulardynamik im kartesischen Raum eingeführt. Es besteht aus: (1) Heizperiode: 500 MD-Schritte bei 100, 200 und 300 K. Positionsbeschränkungen (k = 5 kcal·mol−1 Å−2) werden auf das Protein angewendet, mit Ausnahme der Seitenketten an der Grenzfläche . (2) Probenahmestufe: 1250 MD-Schritte. Auf das Protein werden schwache Positionsbeschränkungen (k = 1 kcal·mol−1 Å−2) angewendet, mit Ausnahme des Rückgrats und der Seitenketten an der Grenzfläche; und (3) Abkühlphase: 500 MD-Schritte bei 300, 200 und 100 K. Schwache (k = 1 kcal·mol−1 Å−2) Positionsbeschränkungen werden nur auf das Proteinrückgrat angewendet, außer an der Grenzfläche. Für die Integration der Bewegungsgleichung wird ein Zeitschritt von 2 fs verwendet und die Temperatur wird durch schwache Kopplung an ein Referenztemperaturbad mit dem Berendsen-Thermostat63 konstant gehalten. Die Berechnungen wurden mit CNS64 durchgeführt. Nichtgebundene Wechselwirkungen wurden mit dem OPLS-Kraftfeld65 unter Verwendung eines Grenzwerts von 8,5 Å berechnet. Das elektrostatische Potential (Eelec) wurde mithilfe einer Verschiebungsfunktion berechnet, während eine Schaltfunktion (zwischen 6,5 und 8,5 Å) zur Definition des Van-der-Waals-Potentials (Evdw) verwendet wurde. Die Strukturberechnungen wurden auf dem HADDOCK-Webserver unter https://alcazar.science.uu.nl/ unter Verwendung der Verfeinerungsschnittstelle durchgeführt. Für jeden Komplex wurden insgesamt 200 Strukturen generiert. (b) Flexibles Andocken von HADDOCK. Zum Einsatz kam der HADDOCK-Docking-Server unter Nutzung der Guru-Schnittstelle. Hier wurden Abstandsbeschränkungen verwendet, indem die abgeleiteten Vernetzungsdaten angewendet wurden, die den LYS-Resten der LD bzw. E1 und E3 entsprechen. Die angewendeten Abstandsbeschränkungen sind in den mit diesem Artikel bereitgestellten haddockparam.web-Dateien enthalten. Für die Docking-Berechnungen wurde standardmäßig die Guru-Schnittstelle verwendet, der Such- und Bewertungsraum wurde jedoch erheblich erweitert. Dies bedeutete, dass die durch it0 erzeugten Strukturen auf N = 10.000 und die bewerteten Strukturen auf N = 400 erhöht wurden. Berechnungen häufiger Aminosäurereste, die an der Bindung der LD beteiligt sind, wurden aus den gebildeten Grenzflächen der N = 400 endgültigen, wasser- raffinierte Docking-Lösungen. Ein Grenzflächenrest wird berücksichtigt, wenn er in der Nähe von 5 Å von jedem anderen Rest der LD liegt. Es werden sehr häufige Rückstände gemeldet, die zum obersten Quartil (über 25 %) der berechneten Häufigkeiten pro Rückstand gehören und mit dem BoxPlotR-Online-Webserver66 aufgezeichnet wurden.

Die OGDHc-Komplexkarte, die aus den experimentellen Kryo-EM-Daten erstellt wurde, wurde verwendet, um die Platzierung der peripheren E1o- und E3-Untereinheiten im Komplex mit der E2o-LD-Domäne zu identifizieren, die durch AlphaFold-Multimer-Vorhersagen wie folgt generiert wurden: Die Karte wurde angezeigt in ChimeraX und nachdem der E2o-Kern in die Mitte eingepasst wurde, wurde er mit dem Segmentkarten-Tool in eine „Kern“-Region und eine „externe“ Dichteregion segmentiert. Dann wurde eine Anpassungssuche von 100 Anpassungen sowohl für E1o-LD- als auch für E3-LD-Komplexe durchgeführt und Kreuzkorrelationswerte (CC) für jede Anpassung aufgelistet und als Anpassung im Kern- oder externen Dichtebereich getrennt. Zur statistischen Signifikanz wurden die beiden CC-Anpassungsgruppen mit einer Einzelfaktor-Varianzanalyse (ANOVA) mit dem Analysis ToolPak in Microsoft Excel (Microsoft Corporation, USA) getestet. Die Werte für die Anpassungen finden Sie in den ergänzenden Abbildungen 10A, B und Ergänzende Daten 3. CC-Plots wurden mit dem BoxPlotR-Online-Webserver erstellt.

C. thermophilum E2o-Linker-Abstandsberechnungen wurden wie folgt durchgeführt: (a) Für die experimentell aufgelösten Abstandsmessungen wurde der Abstand zunächst mit dem Befehl „distance“ in ChimeraX gemessen, nachdem alle peripheren Untereinheiten mit gebundenem LD in die OGDH-Komplexkarte eingepasst wurden vom letzten aufgelösten N-ter-Rest für jede der 3 E2o-Untereinheiten des visuell untersuchten nächstgelegenen E2o-Kernscheitelpunkttrimers bis zu den ersten C-ter-Resten der modellierten LD-Domäne, die entweder an E1o- oder E3-Dimere an der Peripherie gebunden sind. Alle Werte wurden dann gemittelt, und individuelle Messungen und berechnete Standardabweichungen sind in den Zusatzdaten 3 zu finden. Theoretische Berechnungen basierend auf der Länge des ungeordneten Linkers (73 aa, Uniprot-ID: G0SAX9) basierten dann auf abgeleiteten Gleichungen, die von Marsh und Forman-Kay41 veröffentlicht wurden , Wilkins et al.67 und George und Heringa42. Um weitere Erkenntnisse über die Länge ungeordneter Linker auf der Grundlage experimentell aufgelöster Strukturen aus der PDB zu gewinnen, wurde außerdem die vollständige PDB-Datenbank mit Stand vom 1. Juni 2022 heruntergeladen und insgesamt 191.144 Dateien im mmCIF-Format mit mehr als einer halben Million Ketten heruntergeladen analysiert. Fehlende Linkerregionen mit ihren entsprechenden Sequenzen werden anhand der „_pdbx_unobs_or_zero_occ_residues“-Einträge in den mmCIF-Dateien identifiziert und insgesamt 399.404 fehlende Regionen aufgezeichnet. Für jeden fehlenden Regionseintrag werden die links und rechts beobachteten Aminosäuren anhand der Atomkoordinatendaten in den mmCIF-Dateien identifiziert. Für jede Linkerregion werden die folgenden Eigenschaften abgeleitet: (a) der End-to-End-Ca-Ca-Abstand zwischen den beiden beobachteten Resten, gemessen in Å, (b) die Länge der Linkerregion und (c) die Sequenz der Linker-Region. Die Länge dieser fehlenden Regionen variierte von 1 Aminosäure bis zu 3736 Aminosäuren, und bei zunehmender Länge der Linkersequenz wurde eine starke Verringerung der verfügbaren PDB-Einträge beobachtet, wobei der Trend in der ergänzenden Abbildung 10E sichtbar ist. Um bessere kollektive Eigenschaften abzuleiten, wurden die Dateien durch adaptives Erhöhen der Bin-Breite der Länge der Aminosäuren gruppiert. Für 1–50 Aminosäuren wurde die Bin-Breite bei 1 gehalten. Ab 50 erhöht sich die rechte Bin-Kante allmählich auf 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 250 und 4000. Aus Einträgen Wenn in jedes Bin ein Abfall fällt, wurde der Mittelwert der Ca-Ca-Abstände berechnet und der Abstand bei Quantilen variiert von 0,0 bis 1,0 in Schritten von 0,2. Die analysierten Daten sind in den Zusatzdaten 4 dargestellt. In Abb. 9A wurde der mittlere Ca-Ca-Abstand, dargestellt durch schwarze Punkte, gegen die Länge der Linkerregion aufgetragen. Abstände auf Quantilebene (0,0–1,0) wurden als Farbton dargestellt, wie in der Legende angegeben. Als Referenz wurde eine horizontale Linie (blau gepunktet) eingezeichnet, die 3,5 Å entspricht. In ähnlicher Weise wurde eine Linie (durchgehend blau) eingezeichnet, die dem 7-Å-fachen der Länge des fehlenden Bereichs entspricht. Die Beziehung zwischen dem mittleren Ca-Ca-Abstand (y) und der Anzahl der Aminosäuren der fehlenden Sequenz (x) kann empirisch durch eine Modellfunktion der Form charakterisiert werden: \(y=A\left(1-{e} ^{-{bx}}\right)+3,5\), wobei beobachtet wird, dass die Konstanten A und b die Werte 11 bzw. 0,2 haben. Die Modellfunktion wurde als rote Linie dargestellt. Alle Diagramme im Zusammenhang mit PDB-Abstandsberechnungen (Abb. 9A, ergänzende Abb. 10D, E) wurden mit dem Pandas-Paket in Python 3.9 erstellt. Das Blasendiagramm mit allen theoretischen und experimentellen Abstandsberechnungen (ergänzende Abbildung 10C) wurde mit dem Paket ggpubr 0.4.0 in R erstellt.

Rotationsverschiebungsberechnungen der E2o-Vertex-Trimer-Untereinheiten von H. sapiens im Vergleich zu den experimentell aufgelösten C. thermophilum E2o-Vertex-Trimer-Untereinheiten (A, B, C) wurden wie folgt durchgeführt: Zuerst C. thermophilum und H. sapiens (PDB-ID: 6H05). ) E2o-Trimere wurden extrahiert und auf Untereinheit A in PyMol ausgerichtet. Anschließend wurde mit dem Befehl „angle_between_domains“ zunächst der Winkel zwischen C. thermophilum-Untereinheit A und B berechnet. Dasselbe wurde für den Winkel zwischen C. thermophilum-Untereinheit A und H. sapiens-Untereinheit B durchgeführt. Anschließend wurden die Werte subtrahiert. Der gleiche Vorgang wurde für das Untereinheitenpaar A und C durchgeführt, wobei die Rotationsachse wiederum gleich blieb und auf Untereinheit A ausgerichtet war. Eine visuelle Darstellung der gemessenen Domänen ist in der ergänzenden Abbildung 4A zu sehen.

Die Fraktionen 3–9 aus der oben beschriebenen Fraktionierung des nativen C. thermophilum-Lysats wurden in zwei Pools (3–6 und 7–9) zusammengefasst. Von jedem Pool wurden 40 μl Probe in Lösung mit Trypsin verdaut, wie zuvor beschrieben68,69. Um eine Proteinausfällung während der Probenreduktion und Alkylierung zu vermeiden, wurden 2 μl 20 % SDS hinzugefügt. 1 μl 200 mM DTT in 200 mM HEPES/NaOH, pH 8,5, wurde hinzugefügt, um die Proteinproben zu reduzieren, die dann 30 Minuten bei 56 °C inkubiert wurden. Nach der Reduktion folgte die Alkylierung mit der Zugabe von 2 μl 400 mM Chloracetamid in 200 mM HEPES/NaOH, pH 8,5 und einer weiteren Inkubation bei 25 °C für 30 Minuten. Der gesamte Überschuss an Chloracetamid wurde durch Zugabe von 2 μl 200 mM DTT in HEPES/NaOH, pH 8,5, gequencht. Nach Reduktion und Alkylierung wurden die Proben für die Eintopf-Festphasen-verstärkte Probenvorbereitung68,69 verwendet. Für diese Zubereitung wurden 5 μl 10 % v/v Ameisensäure und 2 μl Sera-Mag Beads zusammen mit ausreichend Acetonitril (ACN) hinzugefügt, um einen endgültigen ACN-Prozentsatz von 50 % v/v zu erreichen, gefolgt von einer 8 Min. Inkubation und Perleneinfang auf einem Magnetgestell. Die Perlen wurden dann zweimal unter Zugabe von 200 μl 70 %igem Ethanol und ein weiteres Mal mit 200 μl ACN gewaschen. Nach der Resuspension in 10 μl von 0,8 μg modifiziertem Trypsin in Sequenzierungsqualität in 10 μl 100 mM HEPES/NaOH, pH 8,5, wurden die Perlen über Nacht bei 37 °C inkubiert. Auf die Inkubation folgte ein Umkehrphasen-Reinigungsschritt und die anschließende Analyse durch Flüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) mit einem Q Exactive™ Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap™-Massenspektrometer (ThermoFisher Scientific, USA). Genauer gesagt wurde für die Peptidtrennung ein UltiMate™ 3000 RSLCnano-System (ThermoFisher Scientific, USA) verwendet, das mit einer Auffangkartusche und einer Analysesäule ausgestattet war. Für Lösungsmittel A wurden 0,1 % v/v Ameisensäure in Wasser in LC-MS-Qualität und für Lösungsmittel B 0,1 % v/v Ameisensäure in CAN in LC-MS-Qualität verwendet. Alle Peptide wurden mit einem Lösungsmittel A-Durchfluss von 30 ml·min−1 für 3 Minuten auf die Abfangkartusche geladen und mit 0,3 ml·min−1 für 90 Minuten Analysezeit eluiert, beginnend mit einem 2–28 %igen Lösungsmittel B Elution, dann Erhöhung auf 40 % B, ein weiterer Waschschritt mit 80 % B und schließlich Wiederherstellung des Gleichgewichts auf die Ausgangsbedingungen. Das LC-System wurde mithilfe einer Nanospray-Flex-Ionenquelle und eines Pico-Tip-Emitters mit einem Außendurchmesser von 360 μm und einem Innendurchmesser von 20 μm direkt an das Massenspektrometer gekoppelt. 10 μm Spitze. Das Massenspektrometer wurde im Positivionenmodus mit einer Sprühspannung von 2,3 kV und einer Kapillartemperatur von 275 °C betrieben. Vollscan-MS-Spektren mit einem Massenbereich von 350–1400 m/z wurden im Profilmodus mit einer Auflösung von 70.000 [maximale Füllzeit von 100 ms oder maximal 3e6 Ionen (automatische Verstärkungsregelung, AGC)] aufgenommen. Die Fragmentierung wurde für die obersten 20 Peaks mit der Ladung 2–4 im MS-Scan (datenabhängige Erfassung) mit einem dynamischen Ausschlussfenster von 20 s ausgelöst (normalisierte Kollisionsenergie betrug 26). Vorläufer wurden mit 1,7 m/z isoliert und MS/MS-Spektren wurden im Profilmodus mit einer Auflösung von 17.500 aufgenommen (maximale Füllzeit von 50 ms oder ein AGC-Ziel von 1e5 Ionen). Für die Datenanalyse wurden die MS-Rohdaten mit MaxQuant 1.6.170 analysiert. Die Proteomsequenzen von Chaetomium thermophilum wurden von Uniprot mit der Proteom-ID UP000008066 heruntergeladen. Die MS-Daten wurden anhand der Proteomsequenzen von Chaetomium thermophilum sowie der von MaxQuant bereitgestellten Sequenz häufiger Kontaminanten durchsucht. Die Standardeinstellung von MaxQuant wurde mit Modifikationsoxidation und Acetyl (Protein-N-Term) verwendet. Für die Proteinidentifizierung wurde ein FDR-Grenzwert (False-Discovery Rate) von 1 % verwendet, und für die markierungsfreie Proteinquantifizierung wurde die iBAQ-Intensität verwendet. Bei der Berechnung der iBAQ-Intensität wurden die maximalen Detektorpeakintensitäten des Peptidelutionsprofils als Peptidintensität verwendet. Anschließend wurden alle identifizierten Peptidintensitäten addiert und mit der Gesamtzahl der identifizierten Peptide normalisiert.

Zur Vorbereitung der vernetzenden Massenspektrometrieproben wurde zunächst eine Titration zur Ermittlung der optimalen Vernetzerkonzentration durchgeführt (ergänzende Abbildung 7). Die Fraktionen 3–9 aus der oben beschriebenen nativen Lysatfraktionierung von C. thermophilum (ergänzende Abbildung 7A) wurden auf ein Gesamtvolumen von 1,4 ml und eine Proteinkonzentration von 0,48 mg·ml−1 gepoolt und dann in jeweils 7 Teile gleichen Volumens aufgeteilt Eppendorf-Röhre. Dem ersten Röhrchen wurde kein Vernetzungsmittel zugesetzt, um es als Kontrolle aufzubewahren, während dem Rest jeweils 5 μl 0,16, 0,32, 0,63, 1,25, 2,5 und 5 mM des Vernetzungsmittels BS3 zugesetzt wurden. Die Proben wurden 2 Stunden lang auf Eis inkubiert und die Vernetzungsreaktion anschließend durch Zugabe von 50 mM NH4HCO3 deaktiviert und erneut 30 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Proben wurden dann in ein Aceton-kompatibles Röhrchen überführt und das 4-fache Probenvolumen an kaltem (–20 °C) Aceton hinzugefügt, die Röhrchen wurden gevortext, erneut 60 Minuten lang bei –20 °C inkubiert und 10 Minuten lang zentrifugiert 15.000 × g. Der Überstand wurde ordnungsgemäß entfernt und dann wurden die Röhrchen bei Raumtemperatur offen gelassen, damit das Aceton verdampfen konnte. Zur Visualisierung der Titrationsergebnisse wurden die Pellets der 7 Röhrchen jeweils in 1X SDS-PAGE-Probenladepuffer (verdünnt aus einer 4X-Stammlösung von 250 mM Tris-HCl, pH 6,8, 8 % w/v Natriumdodecylsulfat (SDS)) resuspendiert. 0,2 % w/v Bromphenolblau, 40 % v/v Glycerin, 20 % v/v β-Mercaptoethanol) bis zu einer Endproteinkonzentration von 10/20 μg·mL−1. Die Proben wurden dann 5 Minuten lang bei 90 °C gekocht, auf Mini-PROTEAN® Precast Gels (BioRad, USA) geladen und 60 Minuten lang bei 150 V elektrophorisiert. Nach der Elektrophorese wurden die Gele zweimal in Wasser gewaschen und mit Coomassie-Färbung gefärbt Lösung gelöst und dann entfärbt, bis der Hintergrund des Gels vollständig entfärbt war. Nach visueller Inspektion der Gele wurde eine optimale Konzentration von 1 mM BS3 ausgewählt, um mit der Probenvernetzung fortzufahren (ergänzende Abbildung 7B). Nachdem die optimale Vernetzerkonzentration ermittelt wurde, wurden die Fraktionen 3–9 aus der oben beschriebenen Fraktionierung des nativen C. thermophilum-Lysats erneut gepoolt, diesmal jedoch in zwei Pools, 3–6 und 7–9. In ein Protein-LoBind-Eppendorf-Röhrchen für jeden Pool wurden 100 μl 8 M Harnstoff gegeben und dann über Nacht in einem Zentrifugalvakuumverdampfer bei RT zentrifugiert. 100 μl aus jedem Pool wurden dann in jedes der Röhrchen mit Harnstoffpulver überführt und 100 mM Ammoniumbicarbonat (ABC) hinzugefügt. Anschließend wurde auch DTT bis zu einer Endkonzentration von 2,5 mM zugegeben (aus einer 100 mM DDT-Stammlösung, gelöst in 100 mM ABC) und 30 Minuten bei RT inkubiert. Nachdem die Inkubation beendet war, wurde 2-Iodacetamid (IAA) bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugegeben, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei RT im Dunkeln. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 2,5 mM DTT gestoppt, um eine Modifikation von Serin in den aktiven Zentren des Trypsins zu verhindern. Anschließend wurde LysC (1 μg μL-1 Stammlösung, im Verhältnis 1:100, w/w) zugegeben und die Proben erneut 4,5 Stunden bei RT inkubiert. Eine Zugabe von 50 mM ABC zur Probe reduzierte die Harnstoffkonzentration auf <2 M. Trypsin (aus 1 μg μL−1 Stammlösung, im Verhältnis 1:50, w/w) wurde zu den Proben gegeben, die dann über Nacht bei RT inkubiert wurden , gefolgt vom Entsalzungsverfahren „STOP And Go Extraction“ (STAGE), wie in Ref. beschrieben. 71. Die endgültigen vernetzten Peptidproben wurden dem gleichen LC-MS/MS-Verfahren unterzogen und die Ergebnisse wurden wie oben in der MS-Proteinidentifizierungsmethode beschrieben analysiert. Alle Diagramme zur Visualisierung von MS/XL-MS-Daten wurden mit dem xiVIEW Online-Webserver72 erstellt.

Identifizierte Proteine ​​aus der Massenspektrometrie wurden in den bereitgestellten Anordnungen höherer Ordnung kartiert, die im Artikel von Kastritis et al. beschrieben sind. (2017)19. Diese Anordnungen höherer Ordnung wurden mithilfe der Homologiesuche pro Uniprot-Eintrag in der Proteindatenbank weiter angereichert, um auch mögliche homologe Untereinheiten einzubeziehen, die nach 2017 in PDB-Strukturen aufgelöst wurden. Hierzu wurde Blastp verwendet (https://blast.ncbi.nlm). nih.gov/Blast.cgi?PAGE=Proteins) standardmäßig mit der PDB-Datenbank verglichen. Als nächstes werden in Kastritis et al. bereitgestellte Netzwerke und Communities vorgestellt. (2017) diente als Grundlage für den weiteren Ausbau der Netzwerke, über die in dieser Studie berichtet wird. Dies wurde erreicht, indem die Proteine ​​diesen Netzwerken zugeordnet, in die STRING73-Datenbank aufgenommen und die identifizierten Interaktionen zu einem Netzwerk mit Interaktoren und Gemeinschaften der ersten und zweiten Schale erweitert wurden. Anschließend wurden C. thermophilum-spezifische lokale STRING-Netzwerkcluster abgerufen und die Abdeckung pro String-Cluster wird durch einfache Aufteilung der identifizierten Proteine ​​auf alle im STRING-Cluster vorhandenen Proteine ​​angegeben. Dies wurde von diesen erweiterten Netzwerken aus mittels Backmapping auf die MS- und XL-MS-Daten durchgeführt. Abschließend wurden die Netzwerke anhand des datenbankinternen Anreicherungserkennungskriteriums74 auf biologische Signifikanz überprüft. Dabei zeigte sich, dass alle 54 hier abgeleiteten Cluster (Proteingemeinschaften) signifikant an biologischen Interaktionen angereichert waren. Die Visualisierung der Netzwerke erfolgte mit Cytoscape75. Die Wiederherstellung des vollständigen TCA-Zyklus wurde mithilfe von KEGG76 abgeleitet.

Uniprot-ID: G0S3G5 (C. thermophilum mutmaßliche Holocytochrom-C-Synthase – Sequenzlänge: 382), Uniprot-ID: Q7S3Z3 (charakterisiert in13 als N. crassa-Kgd4-Protein – Sequenzlänge: 130), zusammen mit Uniprot-ID: Q7S3Z2 (N. crassa mutmaßliche Holocytochrom-C-Synthase – Sequenzlänge: 317) wurden im.fasta-Format aus der Uniprot-Datenbank heruntergeladen und mit Clustal Omega77 in zwei separaten Alignment-Paaren abgeglichen: G0S3G5 mit Q7S3Z3 und G0S3G5 mit Q7S3Z2 separat. Die.aln-Dateien wurden heruntergeladen und mit Jalview78 visualisiert. Die Ausrichtungsergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt. Die Protein-IDs in Uniprot wurden aktualisiert, wobei P9WES7 nun der mutmaßlichen Holocytochrom-C-Synthase (Länge: 287 aa) und P9WES8 dem identifizierten E3BPo (Länge: 135 aa) entspricht.

Von AlphaFold2 abgeleitete Modelle für alle Proteine, die an der Bildung des OGDHc-Metabolons beteiligt sind, nämlich E1o, E2o und E3, wurden auf ihre Qualität validiert, indem die intramolekularen Vernetzungen verwendet wurden, die aus der oben durchgeführten Vernetzungsanalyse abgeleitet wurden. Alle identifizierten intramolekularen Vernetzungen von E1o, E2o und E3 wurden mithilfe eines hauseigenen Python-Skripts auf die entsprechenden Modelle abgebildet und manuell auf ihre Machbarkeit überprüft. Die Abstandsverteilungen wurden für jedes Modell in der ergänzenden Abbildung 9A dargestellt, und die entsprechenden Daten sind in den ergänzenden Daten 2 enthalten.

Alle durchgeführten statistischen Analysen werden in den einzelnen Unterabschnitten „Methoden“ angemessen beschrieben und umfassen die für die Analyse verwendeten statistischen Methoden, Konfidenzintervalle, Anzahl biologischer Replikate, Anzahl technischer Replikate, Standardabweichungen und Kreuzkorrelationswerte.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die diese Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Die Quelldaten für alle Zahlen finden Sie in diesem Dokument in den entsprechenden Ergänzungsdatenelementen. Die Kryo-EM-Karte und das Modell für den nativen 24-mer-Kern des OGDHc wurden in EMDB und PDB unter den Zugangsnummern EMD-16900 bzw. 8OIU hinterlegt. Die asymmetrische Kryo-EM-Karte des OGDHc ist in EMD-16900 enthalten. Rohfilme, summierte Mikroaufnahmen und Gitteratlanten wurden bei EMPIAR unter der Zugangsnummer EMPIAR-11502 hinterlegt. Massenspektrometriedaten sind als Ergänzungsdaten 2 verfügbar.

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Wir möchten allen Mitgliedern des Kastritis-Labors für die fruchtbaren Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde von der Europäischen Union durch Förderung des Horizon Europe ERA Chair „hot4cryo“ Projektnummer 101086665 (an PLK), dem Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF, ZIK-Programm) (Fördernummern 03Z22HN23, 03Z22HI2 und 03COV04 an) unterstützt PLK), dem Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) für Sachsen-Anhalt (Fördernummer ZS/2016/04/78115 an PLK), der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Projektnummer 391498659, GRK 2467) und der Martin-Luther-Universität Halle -Wittenberg.

Open-Access-Förderung ermöglicht und organisiert durch Projekt DEAL.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Christian Tüting.

Interdisciplinary Research Center HALOmem, Charles Tanford Protein Center, Martin Luther University Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Straße 3a, 06120, Halle/Saale, Germany

Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Christian Tüting, Farzad Hamdi, Toni K. Träger, Jaydeep Belapure & Panagiotis L. Kastritis

Institut für Biochemie und Biotechnologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Straße 3, 06120, Halle/Saale, Deutschland

Ioannis Skalidis, Fotis L. Kyrilis, Toni K. Träger und Panagiotis L. Kastritis

Biozentrum, Martin Luther University Halle-Wittenberg, Weinbergweg 22, 06120, Halle/Saale, Germany

Gerd Hause & Panagiotis L. Kastritis

Abteilung für Pflanzenbiochemie, Institut für Biochemie und Biotechnologie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Kurt-Mothes-Str. 3a, 06120, Halle/Saale, Deutschland

Marta Fratini & Ingo Heilmann

Zentrum für Strukturbiologie, Zentrum für Krebsforschung, National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD, 21702-1201, USA

Francis J. O'Reilly

Bioanalytics, Institute of Biotechnology, Technische Universität Berlin, 13355, Berlin, Germany

Es zeigt Rappsilber

Wellcome Centre for Cell Biology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, Edinburgh, EH9 3BF, Schottland, Vereinigtes Königreich

Es zeigt Rappsilber

Institut für Chemische Biologie, National Hellenic Research Foundation, Athen, 11635, Griechenland

Panagiotis L. Kastritis

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FLK führte die experimentellen Arbeiten durch, unterstützt von FJO bei der Massenspektrometrie und TKT bei kinetischen Tests. GH und MF führten eine Zellbildgebung durch. FH hat die mikroskopischen Aufnahmen erworben. IS berechnete die Kryo-EM-Rekonstruktionen und führte eine Computermodellierung durch. CT führte eine Computermodellierung durch. JB führte eine statistische Analyse der Linkerabstände durch. PLK, IH und JR sicherten sich die Finanzierung. PLK hat das Projekt konzipiert. IS und PLK haben das Manuskript mit Beiträgen aller Autoren verfasst.

Korrespondenz mit Panagiotis L. Kastritis.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Das Manuskript wurde ohne weitere Begutachtung bei Communications Biology als zur Veröffentlichung geeignet erachtet. Hauptredakteur: Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Skalidis, I., Kyrilis, FL, Tüting, C. et al. Strukturanalyse eines endogenen 4-Megadalton-Succinyl-CoA-erzeugenden Metabolons. Commun Biol 6, 552 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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Eingegangen: 13. März 2023

Angenommen: 27. April 2023

Veröffentlicht: 22. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04885-0

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