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Aug 31, 2023

Urinkonzentrationen von GHB und seinen neuartigen Aminosäure- und Carnitin-Konjugaten nach kontrollierter GHB-Verabreichung beim Menschen

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 8983 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Gamma-Hydroxybutyrat (GHB) bleibt ein klinisch/forensisch-toxikologisches Medikament mit Herausforderungen. Dies ist vor allem auf die schnelle Ausscheidung auf endogene Mengen zurückzuführen. Insbesondere bei drogenunterstützten sexuellen Übergriffen erfolgt die Probenentnahme oft später als das Nachweisfenster für GHB. Unser Ziel war es, neue GHB-Konjugate mit Aminosäuren (AA), Fettsäuren und ihren organischen Säuremetaboliten auf ihre Eignung als Aufnahme-/Anwendungsmarker im Urin nach kontrollierter GHB-Verabreichung beim Menschen zu untersuchen. Wir verwendeten LC-MS/MS zur validierten Quantifizierung menschlicher Urinproben, die im Rahmen von zwei randomisierten, doppelblinden, placebokontrollierten Crossover-Studien (GHB 50 mg/kg, 79 Teilnehmer) etwa 4,5, 8, 11 und 28 Stunden danach gesammelt wurden Aufnahme. Wir fanden nach 4,5 Stunden bei allen bis auf zwei Analyten signifikante Unterschiede (Placebo vs. GHB). Elf Stunden nach der GHB-Verabreichung zeigten GHB, GHB-AAs, 3,4-Dihydroxybuttersäure und Glykolsäure immer noch deutlich höhere Konzentrationen; nach 28 h nur GHB-Glycin. Es wurden drei verschiedene Unterscheidungsstrategien bewertet: (a) GHB-Glycin-Grenzwertkonzentration (1 µg/ml), (b) Metabolitenverhältnisse von GHB-Glycin/GHB (2,5) und (c) Erhöhungsschwelle zwischen zwei Urinproben ( > 5). Die Empfindlichkeiten betrugen 0,1, 0,3 bzw. 0,5. Lediglich GHB-Glycin zeigte gegenüber GHB einen längeren Nachweis, vor allem im Vergleich zu einer Urinprobe, die zum zweiten Mal und zum gleichen Probanden abgeglichen wurde (Strategie c).

Gamma-Hydroxybutyrat (GHB), eine kurzkettige Fettsäure, stellt einen wichtigen Analyten in der klinischen und forensischen Toxikologie dar, nicht nur wegen seines Freizeitkonsums als Droge des Missbrauchs (DOA), sondern auch wegen seiner Verwendung bei drogenfinanzierten Straftaten oder drogenunterstützte sexuelle Übergriffe (DFSA)1,2,3. Matrizen wie Blut oder Urin erlauben nur kurze Nachweisfenster für GHB von bis zu 6 bzw. 12 Stunden4. Erschwerend kommt hinzu, dass GHB auch eine endogene Verbindung ist5,6, was es besonders schwierig macht, niedrige exogene GHB-Spiegel nach der Einnahme/Verabreichung von GHB von endogenen Spiegeln zu unterscheiden. Im Urin werden üblicherweise Grenzwerte zwischen 6 und 10 µg/ml empfohlen, um zwischen endogenen GHB-Spiegeln und der GHB-Aufnahme zu unterscheiden1,5,7. Dennoch sind zusätzliche Biomarker erforderlich, um die GHB-Erkennung und -Interpretation über längere Zeiträume zu verbessern. GHB-Glucuronid und GHB-Sulfat wurden ausführlich untersucht. Obwohl kontrovers diskutiert, fanden die meisten Studien keine Vorteile beim Nachweis von GHB-Glucuronid8,9,10,11. In jüngerer Zeit haben organische Säuren, die durch den Abbau oder die Beta-Oxidation von GHB entstehen, als zusätzliche Biomarker an Aufmerksamkeit gewonnen. Endogene Konzentrationen von 2,4-Dihydroxybuttersäure (2,4-DHB), 3,4-DHB, Glykolsäure (GA), Bernsteinsäure (SA) und Succinylcarnitin wurden in größeren Kohorten12,13 sowie deren allgemeine Nützlichkeit systematisch bestimmt bei der Verbesserung der GHB-Erkennungsfenster und -Interpretation wurde gezeigt14,15,16. Neue Konjugate von GHB (Abb. 1) mit Carnitin, Aminosäuren (Glycin, Glutamat, Taurin, Phenylalanin), Pentose, Fettsäuren, Phospholipiden und einigen noch unbekannten Merkmalen (U3, U4, U16) deuteten ebenfalls auf vielversprechende zusätzliche GHB-Marker hin . Sie wurden entweder durch ungezielte metabolische Profilierung17,18 oder hypothesengesteuerte Ansätze19,20,21 entdeckt. Systematische Studien zu ihren Urinkonzentrationen stehen allerdings noch aus. Daher wollten wir die Urinausscheidung von GHB, GHB-Carnitin, GHB-Glycin, GHB-Glutamat, GHB-Taurin, GHB-Phenylalanin, GHB-Fettsäureestern (C8–C18, C18:1) und organischen Säuren 2 quantitativ charakterisieren ,4-DHB, 3,4-DHB, GA, SA, Succinylcarnitin nach kontrollierter Verabreichung von GHB an Menschen und zur Bewertung ihrer Nützlichkeit für die Langzeiterkennung der GHB-Einnahme/-Anwendung unter Verwendung von drei verschiedenen Unterscheidungsstrategien.

Chemische Strukturen neu identifizierter GHB-Konjugate mit den Aminosäuren Glycin, Glutamat und Taurin (links), Carnitin, Fettsäuren oder Pentose (rechts).

Die Konzentrationen jedes Teilnehmers, die mithilfe einer validierten Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Methode (LC-MS/MS)21 und des Kreatinins im Urin bestimmt wurden, sind in Tabelle S1 aufgeführt. Ein Vergleich der berechneten Konzentrationen zwischen 12C- und 13C-Isotopen zeigte eine gute Übereinstimmung innerhalb des Kalibrierungsbereichs, jedoch eine schlechtere Übereinstimmung für 12C in höheren Konzentrationen (ergänzende Abbildung S1). Folglich wurden 13C-Ergebnisse als Näherungswerte für GHB-Konzentrationen in Proben verwendet, die über der Kalibrierung lagen. Tabelle 1 enthält eine Zusammenfassung (Mittelwert, Median, Bereich) der Konzentrationen, die für jede Erkrankung ohne bzw. angepasst an Kreatinin ermittelt wurden. Es wurde festgestellt, dass die Kreatininkonzentrationen unabhängig von Behandlung, Geschlecht oder Krankheit waren, zeigten jedoch die erwartete Schwankung innerhalb eines Tages (Studie II, 11 Stunden, ergänzende Abbildung S2). GHB-Carnitin- und GHB-Aminosäure-Konjugate wurden sowohl in Placebo- als auch in GHB-Sitzungen nachgewiesen. Lediglich die GHB-Taurin-Konzentrationen lagen in allen Placebo-Proben unter der Bestimmungsgrenze (LOQ) von 0,05 µg/ml. GHB-Fettsäurekonjugate konnten in keinem Behandlungszustand nachgewiesen werden. Wie erwartet wurden die höchsten Konzentrationen aller gemessenen Verbindungen in der ersten Urinprobe beobachtet, die während der GHB-Sitzung entnommen wurde. Im Vergleich zu einer begrenzten Anzahl authentischer Fälle, die in früheren Studien veröffentlicht wurden (ForTox Pos. 121, ForTox Pos. 215, jeweils n = 7, Tabelle 1), waren die nach kontrollierter Verabreichung (4,5 Stunden) ermittelten Konzentrationen für alle Verbindungen mit Ausnahme von GHB-Carnitin niedriger. Die Spearman-Korrelation zwischen nicht angepassten und Kreatinin-angepassten Konzentrationen war hoch (r > 0,8). Nur DHB-Isomere und GHB-Glucuronid (r 0,4–0,6), SA und Succinylcarnitin (r 0,6–0,7) zeigten eine schlechte (bessere) Korrelation (ergänzende Abbildung S3). Der Vergleich zwischen 4,5-Stunden-Proben aus den Kohorten I und II ergab keine relevanten Unterschiede, mit Ausnahme von GHB-Carnitin, wo in Studienkohorte I signifikant höhere Konzentrationen gemessen wurden. Die Aminosäurekonjugatkonzentrationen waren in Kohorte II etwas höher. Die Konzentrationen waren unabhängig von Alter, Geschlecht und zugrunde liegender depressiver Störung. Lediglich die SA-Konzentrationen waren bei Frauen zu jedem Zeitpunkt signifikant höher und die 2,4-DHB-Konzentration bei depressiven Patienten nach 4,5 Stunden (ergänzende Abbildung S4). Wir stellten fest, dass die endogenen Konzentrationen von GHB und GHB-Metaboliten (Placebo) unabhängig von der Tageszeit waren, mit Ausnahme von GHB-Glucuronid und Succinylcarnitin, die am Nachmittag signifikant niedrigere Konzentrationen aufwiesen (Abb. 3, ergänzende Abb. S5). Die Spearman-Korrelation der Metabolitenkonzentrationen mit denen von GHB in der Studienkohorte II war nach 4,5 Stunden und 11 Stunden hoch und nach 28 Stunden moderat, wie in repräsentativen Beispielen in Abb. 2A gezeigt. Im Gegensatz dazu hatte die anfängliche Konzentration keinen Einfluss auf die Konzentrationen zu späteren Zeitpunkten, was durch die fehlende Korrelation zwischen den frühen Urinkonzentrationen (4,5 Stunden) und denen nach 11 bzw. 28 Stunden angezeigt wird (Abb. 2B).

Korrelationsanalyse (Spearman, r) zwischen (A) der GHB-Konzentration im Urin (x-Achse) und den GHB-Glycin- oder 3,4-DHB-Konzentrationen nach 4,5 Stunden (hellgrau), 11 Stunden (dunkelgrau) und 28 Stunden (schwarz). ) nach GHB-Einnahme und (B) Korrelation zwischen den Konzentrationen nach 4,5 Stunden im Vergleich zu denen nach 11 Stunden (dunkelgrau) und 28 Stunden (schwarz). Durchgezogene Linien stellen Ergebnisse für lineare Korrelation dar.

Konzentrationen, die aus Placebo- und GHB-Sitzungen der Studienkohorte II 4,5, 11 und 28 Stunden nach der Einnahme abgeleitet wurden, sind als Boxplots in Abb. 3 und der ergänzenden Abb. S5 dargestellt. Die Konzentrationen jedes Teilnehmers werden als repräsentative Beispiele für GHB, GHB-Glycin und GHB-Carnitin, 3,4-DHB und GA angezeigt (ergänzende Abbildung S6). Signifikante Unterschiede zwischen der Placebo- und der GHB-Behandlung wurden für alle Analyten mit Ausnahme von SA und Succinylcarnitin zum frühesten Zeitpunkt der Sammlung beobachtet. Elf Stunden nach der GHB-Verabreichung wiesen GHB, GHB-Aminosäuren, 3,4-DHB und GA immer noch signifikant höhere Konzentrationen auf als Placebo. 28 Stunden nach der Einnahme erlaubte nur GHB-Glycin eine statistische Unterscheidung. GHB-Pentose und Merkmal U4 zeigten ein gewisses Potenzial zur Unterscheidung von exogenem und endogenem GHB.

Boxplots der Urinkonzentrationen für Placebo (hellgrau) und GHB-Behandlung (dunkelgrau), erfasst in Studie II 4,5, 11 und 28 Stunden nach der Einnahme. Der statistische Vergleich wurde mithilfe eines einseitigen, nichtparametrischen Mann-Whitney-Tests durchgeführt (p < 0,05): *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001.

Basierend auf den Placebo-Konzentrationen wurden Grenzwerte ausgewählt und auf ihre Empfindlichkeit getestet, um die GHB-Aufnahme zu den verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung festzustellen. Die Ergebnisse für Spezifität, Sensitivität und PPV sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Unter Verwendung der ausgewählten Grenzwerte schnitt GHB-Glycin im Vergleich zu GHB (Sensitivität 0,4 vs. 0,1) oder anderen Biomarkern (z. B. 3,4-DHB-Sensitivität 0,1) besser ab. bis mindestens 11 Uhr. Nach 28 Stunden ermöglichte selbst GHB-Glycin jedoch nur in 9 % der Fälle den Nachweis/die Unterscheidung von GHB von endogenen Konzentrationen.

Die Metabolitenverhältnisse (Metabolit/GHB, MR) stiegen von 4,5 auf 28 Stunden nach der GHB-Behandlung, jedoch nicht nach der Placebo-Behandlung, wie repräsentativ für GHB-Glycin, GHB-Carnitin, 3,4-DHB und GA in Abb. 4 dargestellt ist. Der höchste GHB-Wert Die Konzentrationen wurden 4,5 Stunden nach der GHB-Verabreichung beobachtet und führten im Vergleich zu Placebo zu deutlich verringerten MRs. Lediglich die Interquartilbereiche (IQR) von GHB-Glycin übertrafen die unter Placebo-Bedingungen beobachteten Werte. Die Annahme des höchsten IQR-MR der Placebo-Behandlung (2,5) als vorläufiger Grenzwert führte nach 11 Stunden zu einer geringeren Sensitivität (0,3) und Spezifität (0,9) im Vergleich zu Strategie a). Die Sensitivität (0,3) mit ähnlicher Spezifität verbesserte sich nach 28 Stunden.

Metabolitenverhältnisse (Analyt/GHB-Konzentration) für Placebo (hellgrau) und GHB-Behandlung (dunkelgrau), berechnet aus Urinproben in Studie II 4,5, 11 und 28 Stunden nach der Einnahme. Die gepunkteten Linien stellen den höchsten und niedrigsten Interquartilbereich der Placebo-Behandlung über alle Erhebungszeitpunkte dar.

Darüber hinaus haben wir den Nutzen erhöhter Analytwerte (> 5) zwischen zwei (subjekt- und zeitangepassten) Urinproben bewertet. Insgesamt wurden bessere Empfindlichkeiten im Vergleich zu einer allgemeinen Cut-Off-Anwendung beobachtet (Strategie a; Tabelle 2). Nach 28 Stunden würden etwa 50 % oder sogar 90 % der GHB-positiven Fälle korrekt durch GHB-Glycin bzw. GHB-Pentose klassifiziert werden. Für GHB-Glycin wurde jedoch eine etwas geringere Spezifität festgestellt, da in einigen Urinpaaren eine Probe negativ für den entsprechenden Biomarker war.

Die aktuelle Interpretation der GHB-Urinkonzentrationen muss noch verbessert werden, und es wurden mehrere Studien durchgeführt, um neue Biomarker zu finden8,9,10,11,12,15,16,17,18,19,22,23. Wir haben kürzlich neue GHB-Konjugate im Urin mit verschiedenen Aminosäuren oder Carnitin vorgeschlagen (Abb. 1)17,18, es fehlen jedoch quantitative Daten über längere Zeitintervalle nach der GHB-Einnahme. Die aktuelle Studie ist die erste, die quantitative Werte für GHB, seine Konjugate und organischen Säuren nach kontrollierter GHB-Verabreichung an Menschen liefert.

Urinproben aus zwei Studienkohorten (79 Teilnehmer) wurden (erneut) analysiert. Während die Studienkohorte II aus einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie bestand (ca. 6 Monate Lagerung bei – 80 °C), wurde die Studienkohorte I ca. 2 Monate lang gelagert. 8 Jahre (− 80 °C) vor der Quantifizierung in der aktuellen Studie. Die Langzeitstabilität während der Methodenvalidierung wurde für bis zu drei Monate bei −20 °C getestet. Es wurde ein Trend zu sinkenden Konzentrationen von Aminosäurekonjugaten beobachtet, aber nur GHB-Carnitin nahm signifikant ab21. Dementsprechend waren der Mittelwert und die Bandbreite der GHB-Aminosäurekonjugate in Urinproben, die 4,5 Stunden nach der GHB-Einnahme in Studienkohorte I gesammelt wurden, etwas niedriger als in Kohorte II. Insgesamt belegen diese Ergebnisse eine ausreichende Stabilität von GHB-Aminosäurekonjugaten, zumindest bei Lagerung bei –80 °C. Überraschenderweise fanden wir in Kohorte I vs. II signifikant höhere Konzentrationen für GHB-Carnitin (Tabelle 1). Allerdings hat sich GHB-Carnitin auch in extrahierten Proben als instabil erwiesen. Die Substanz ist stark hygroskopisch und unter normalen Laborbedingungen schwer zu handhaben. Um Interpretationsprobleme aufgrund der Probenlagerung zu vermeiden, konzentrierten wir die primäre Datenauswertung aufgrund der langen, übereinstimmenden Probensammlung auf die Studienkohorte II.

Das natürlich vorkommende 13C-Isotop macht normalerweise etwa 1,1 % aller Kohlenstoffatome aus und erzeugt ein viel geringeres MS-Signal als 12C, was nachweislich den Dynamikbereich erhöht24,25. Bei der Methodenvalidierung konnten wir zeigen, dass die über das 13C-Isotop berechneten GHB-Konzentrationen gut mit den Ergebnissen einer früheren GHB-Methode übereinstimmten21. Der Schwerpunkt der vorliegenden Studie lag auf neuen GHB-Metaboliten, insbesondere auf der Differenzierung zwischen endogenen Spiegeln und exogener GHB-Aufnahme. Daher betrachteten wir die 13C-Ergebnisse als Näherungswerte für GHB-Konzentrationen in Proben, die über dem Kalibrierungsbereich lagen, als ausreichend und verzichteten auf weitere Verdünnungsschritte.

Ob quantitative Urinkonzentrationen an den Kreatininspiegel angepasst werden sollten, wird kritisch diskutiert26. Bei Punkturinproben wird häufig eine Kreatininanpassung empfohlen, um den individuellen Verdünnungsstatus zu berücksichtigen27. In der klinischen und forensischen Toxikologie wird das Kreatinin im Urin typischerweise als Validitätsparameter bestimmt28,29, bei der Interpretation der Arzneimittelkonzentrationen im Urin werden die Kreatininspiegel jedoch üblicherweise nicht berücksichtigt. Wir beobachteten eine starke Korrelation zwischen Kreatinin-angepassten und nicht angepassten Konzentrationen, mit Ausnahme der DHB-Isomere. Dementsprechend konzentrierten wir uns auf Ergebnisse und Diskussionen zu nicht angepassten Konzentrationen.

Wir haben GHB-Konjugate unter allen Bedingungen und Sammelzeitpunkten nachgewiesen, allerdings nicht in allen einzelnen Urinproben (Tabelle 1). Alter, Geschlecht oder depressive Störung hatten keinen Einfluss auf die Konzentrationen. Lediglich Fettsäureester blieben in allen Urinproben nicht nachweisbar, was höchstwahrscheinlich auf ihre hohe Lipophilie und die daraus resultierende schlechte renale Ausscheidung zurückzuführen ist.

Um endogene Spiegel von Rückständen exogener Anwendung zu unterscheiden, ist die Kenntnis endogener Spiegel und ihrer möglichen intra-/intertägigen Schwankungen erforderlich. Wir fanden signifikante Schwankungen nur für Succinylcarnitin, während DHB-Isomere und GHB-Glycin einen leichten, nicht signifikanten Trend zu höheren Werten am frühen Morgen zeigten. Insgesamt lagen die Konzentrationen organischer GHB-Säuren in Placebo-Proben in ähnlichen Bereichen wie zuvor von Kim et al.13 veröffentlicht und im Allgemeinen etwas niedriger im Vergleich zu Jarsiah et al.12 Für neue GHB-Konjugate stellen wir erste Daten zur Verfügung. Dennoch müssen mehr Proben ohne GHB-Anwendung analysiert werden, um endogene Konzentrationen zuverlässig zu bestimmen. Zukünftige Studien könnten auch auf noch niedrigere LOQs für GHB-Phenylalanin und GHB-Taurin abzielen.

Nach der GHB-Behandlung fanden wir die höchsten Konzentrationen zum frühesten Probenahmezeitpunkt. Für organische Säuren stimmen unsere Ergebnisse aus dieser größeren Kohorte mit früheren Erkenntnissen von Kueting et al. überein. nach GHB-Einnahme bei fünf Narkoleptikern (22–34 mg/kg Körpergewicht)16. Im Vergleich zu einer begrenzten Anzahl authentischer Fälle (Tabelle 1, ForTox Pos. 121) waren die nach kontrollierter Verabreichung (4,5 Stunden) ermittelten Konzentrationen jedoch für alle Verbindungen mit Ausnahme von GHB-Carnitin niedriger. Jarsiah et al. bestimmte ähnliche Konzentrationen für DHB-Isomere und GA in forensischen GHB-Fällen (Tabelle 1, ForTox Pos. 215). Mögliche Erklärungen sind eine frühere Urinsammlung oder höhere konsumierte/verabreichte GHB-Dosen. In forensischen Fällen ist der Zeitpunkt der Probenahme im Zusammenhang mit der Medikamenteneinnahme und den eingenommenen Dosen meist nicht bekannt. Auch die Probenlagerung und die Stabilität des Analyten können von entscheidender Bedeutung sein. Jüngste Langzeitstabilitätsexperimente über einen Zeitraum von drei Monaten zeigten einen signifikanten Anstieg der 2,4- und 3,4-DHB-Spiegel bei GHB-positiven, jedoch nicht bei GHB-negativen Fällen. Dieser Effekt wurde jedoch für GA- oder GHB-Konjugate nicht gezeigt21.

Die Konzentrationen der GHB-Metaboliten, mit Ausnahme von GHB-Carnitin, SA und Succinylcarnitin, zeigten eine hohe Korrelation mit denen von GHB, insbesondere bei den höchsten Konzentrationen, die durch exogene Anwendung erreicht wurden. Wir beobachteten eine schwächere Korrelation zu späteren Zeitpunkten (28 Stunden), wo die Konzentrationen mit hoher Wahrscheinlichkeit endogenen Ursprungs sind, insbesondere bei organischen Säuren (Abb. 2). Für 3,4-DHB scheinen die Steigungen zwischen Korrelationen exogenen und endogenen Ursprungs unterschiedlich zu sein. Die Konjugat- oder organischen Säurekonzentrationen mehrere Stunden nach der GHB-Einnahme waren nicht von der anfänglichen GHB-Konzentration abhängig. Leider standen jedoch nur drei Zeitpunkte zur Verfügung, die keine Berechnung der Eliminationsraten und der zugrunde liegenden Kinetik ermöglichten. Zweitens wurde die erste Urinprobe nach 4,5 Stunden entnommen, was nicht unbedingt die erreichte maximale Konzentration im Urin widerspiegelt.

Daher kann auf Grundlage der verfügbaren kontrollierten Daten nicht vollständig ausgeschlossen werden, dass höhere GHB-Dosen (nicht) zu höheren Konzentrationen an GHB-Konjugaten führen, was möglicherweise auch mit einer längeren Nachweisbarkeit verbunden ist.

Die mittleren GHB-Konzentrationen lagen bereits 11 Stunden nach der Einnahme unter den empfohlenen GHB-Grenzwerten von 10 oder 6 µg/ml, was mit den bekannten Nachweisfenstern von GHB4 übereinstimmt. Dennoch waren die Konzentrationen immer noch statistisch signifikant höher als nach Placebo. Die erste explorative Suche nach Biomarkern17,18 weckte die Hoffnung, dass GHB-Aminosäurekonjugate nicht endogen vorkommen, was sie zu idealen Kandidaten als exogene GHB-Marker macht. Die empfindlicheren analytischen Nachweismethoden der vorliegenden Studie zeigten jedoch auch geringe endogene Mengen dieser Konjugate. GHB-Pentose war der einzige Analyt, der in Placebo-Urinproben kaum vorhanden war (<10 %), aber nach 28 Stunden noch nachweisbar war (ergänzende Abbildung S6). Leider ist kein Referenzmaterial verfügbar und ohne Methodenvalidierung und Quantifizierung für diesen Parameter bleiben die Schlussfolgerungen begrenzt. Gleiches gilt für die noch unbekannte Verbindung U4. Da ein klarer Zusammenhang mit der GHB-Verabreichung besteht, ist die Aufklärung der Struktur für weitere Studien von wesentlicher Bedeutung17.

Basierend auf der höchsten endogenen Konzentration pro Analyt, die in Urinproben aus einer Placebo-Behandlung nachgewiesen wurde (entspricht 100 % Spezifität), haben wir Grenzwerte für GHB-Metaboliten ausgewählt und sie auf ihre Empfindlichkeit getestet, um die GHB-Aufnahme zu verschiedenen Zeitpunkten zu erkennen. Wenn darüber hinaus die Konzentrationen in authentischen Proben (Tabelle 1) die in den kontrollierten Studienkohorten überstiegen, wurde ein zweiter, höherer Grenzwert ausgewertet, der einer früheren Veröffentlichung entsprach oder dieser sehr ähnlich war15. GHB-Glycin (vorläufiger Grenzwert 1 µg/ml) erweist sich als der vielversprechendste Biomarker, der das Nachweisfenster von GHB auf etwa 28 Stunden verlängern kann, jedoch immer noch nicht mit der gewünschten Empfindlichkeit von idealerweise nahe eins. Kueting et al. beschrieben erhöhte Kreatinin-bereinigte Konzentrationen von 2,4-DHB, 3,4-DHB und GA im Urin nach der Einnahme von GHB für bis zu 22 Stunden im Vergleich zu einer auf den Patienten abgestimmten anfänglichen endogenen Konzentration vor der Einnahme von GHB16. Diese Erkenntnisse konnten in unserem Datensatz nicht bestätigt werden. Nur 3,4-DHB ermöglichte eine korrekte Identifizierung der GHB-Aufnahme für etwa 11 Stunden, allerdings immer noch mit geringer Sensitivität (14 %). Interessanterweise wiesen dieselben Urinproben (H19, H20, H21, P21 und P25) im Vergleich zu den anderen Teilnehmern höhere Konzentrationen für GHB, GHB-Glycin, GHB-Pentose und 3,4-DHB auf, insbesondere nach 11 Stunden und manchmal nach 28 h (Ergänzende Abbildung S6). Bisher konnte dieser Befund nicht erklärt werden, es zeigte sich jedoch, dass er unabhängig von Alter, Geschlecht, Begleitmedikation oder Kreatinin im Urin ist.

Die Verabreichung von GHB führt zu um ein Vielfaches höheren GHB-Urinkonzentrationen im Vergleich zu endogenen Werten. Folglich führt die Berechnung der MRs von GHB-Metaboliten gegenüber den GHB-Konzentrationen zunächst zu extrem niedrigen MRs im Vergleich zu Placebo, die im Laufe der Zeit auf endogene Verhältnisse ansteigen oder diese übertreffen (Abb. 4). Wenn GHB-Metaboliten langsamer eliminiert werden als GHB, sollten die entsprechenden MRs zu späteren Zeitpunkten diejenigen von Fällen ohne GHB-Zufuhr übersteigen. Von allen ausgewerteten MRs folgte nur GHB-Glycin dem erwarteten Trend, während die Medianwerte immer noch innerhalb der Placebo-Grenzwerte lagen. Die Auswahl des höchsten IQR-MR der Placebo-Behandlung als vorläufigen Grenzwert führte zu einer leicht überlegenen, aber immer noch zu geringen Empfindlichkeit für die korrekte Erkennung der GHB-Aufnahme in 28-Stunden-Urinproben im Vergleich zum Einzelkonzentrations-Cut-off.

Als dritten Unterscheidungsansatz haben wir eine Verhältnisbestimmung zwischen zwei Urinproben derselben Person getestet und dabei den endogenen Spiegel einer Person berücksichtigt. Wir verwendeten zeitlich abgestimmte Placeboproben für eine vorläufige Bewertung, um Analytschwankungen innerhalb eines Tages zu vermeiden. Die Analysemethode war nicht empfindlich genug, um in allen Placeboproben quantitative Werte für GHB-Konjugate zu erhalten. Eine Verhältnisbildung auf Basis berechneter Konzentrationen war daher nicht in ausreichenden Fällen möglich. Stattdessen haben wir Peakflächenverhältnisse (Analyt/interner Standard (IS)) verwendet, mit dem zusätzlichen Vorteil, dass kein Referenzmaterial erforderlich ist. Solche Standards wurden teilweise selbst synthetisiert und sind noch nicht kommerziell erhältlich30. Häufigkeitsunterschiede in Placebo-Urinproben (4,5 h vs. 28 h) wurden als Kohorte ohne exogenes GHB verwendet und zeigten maximale Erhöhungen von 5 (Ausnahme GHB, GHB-Glutamat, GHB-Phenylalanin, SA). Daher wurde fünf als mögliche Höhenschwelle ausgewählt. Verbindungen, die in einzelnen Proben nicht nachweisbar waren, erhielten ein fiktives Verhältnis von Peakfläche zu IS von 0,00001 (Mindestfaktor 100 niedriger als die niedrigsten echten Probenwerte), um eine Division durch Nullfehler zu vermeiden. Dieser Ansatz ergab eine viel höhere Empfindlichkeit, auch 28 Stunden nach der GHB-Einnahme. Es wurden schlechtere Spezifitätswerte beobachtet, die durch (Placebo-)Urinpaare verursacht wurden, bei denen in einer der Proben keine Analyten nachweisbar waren. Unter diesen Umständen würden bereits sehr niedrige Werte in den ersten Urinproben zu einer theoretisch unendlichen Erhöhung führen. Am Beispiel von GHB-Glycin erhöhte die Entfernung der sechs Paare mit nicht nachweisbarem GHB-Glycin in einer der Proben die Spezifität erneut von 0,85 auf 1. Unsere vorläufigen Daten legen nahe, dass der Vergleich mit einer zweiten Urinprobe die beste Strategie zur Verbesserung des GHB-Nachweises sein könnte . Dennoch sind weitere Daten, die Bestätigung der vorgeschlagenen Höhenschwellenwerte und die Auswertung der Ergebnisse von doppelten Routinefallproben erforderlich. Wir empfehlen daher, Urinproben 24 Stunden (zeitlich abgestimmt) nach der ersten Probe zu entnehmen.

Unsere Studie hatte einige Einschränkungen, da die erneut analysierten Proben aus Studien stammten, die ursprünglich nicht für unsere Forschungsfrage konzipiert waren. Zusätzlich wurde eine therapeutische (Narkolepsie-) GHB-Dosis verabreicht, während in DFSA-Fällen üblicherweise höhere Dosen verwendet werden. Es standen nur drei Sammelzeitpunkte bis zu 28 Stunden zur Verfügung, sodass keine ordnungsgemäße pharmakokinetische Analyse (z. B. Eliminationsrate) möglich war.

Wir liefern die ersten umfassenden Daten zu verschiedenen GHB-Biomarkern nach kontrollierter Gabe von GHB. Als zusätzliche GHB-Nachweismarker erwiesen sich GHB-AA-Konjugate und 3,4-Dihydroxybuttersäure als geeignet. Folglich sollte die aktuelle GHB-Analyse von GHB nur auf mehrere andere Biomarker ausgeweitet werden. Allerdings zeigte nur GHB-Glycin gegenüber GHB einen längeren Nachweis. Die besten Empfindlichkeiten wurden erzielt, wenn eine Urinprobe mit einer zweiten Urinprobe verglichen wurde, deren Probanden mit der gleichen Person übereinstimmten (Strategie c). Dennoch könnte die Entnahme einer zweiten Urinprobe von DFSA-Opfern von entscheidender Bedeutung sein, und vor der endgültigen Bewertung müssen (mehr) Routineproben mit diesem Ansatz analysiert werden.

Wir verwendeten Urinproben aus zwei randomisierten, ausgewogenen, doppelblinden, placebokontrollierten Crossover-Studien, die in Zürich, Schweiz, durchgeführt wurden. Sie wurden ursprünglich entwickelt, um die schlaffördernde Wirkung von GHB bei gesunden Teilnehmern (Studie I) und die gedächtnissteigernde Wirkung bei gesunden Teilnehmern und Patienten mit schweren depressiven Störungen (Studie II) zu charakterisieren. Die Genehmigung wurde von der kantonalen Ethikkommission Zürich und der Swissmedic erteilt. Die Studien wurden bei ClinicalTrials.gov (NCT02342366 bzw. NCT04082806) registriert und alle Studienprotokolle und -methoden entsprachen den relevanten Richtlinien und der Erklärung von Helsinki. GHB (50 mg/kg Körpergewicht Xyrem®) oder Placebo wurden gelöst in 2 dl Orangensaft verabreicht. Zwischen den Sitzungen (Placebo und GHB) wurde eine Auswaschphase von sieben Tagen eingehalten. Alle Teilnehmer wurden über potenzielle Risiken aufgeklärt und gaben eine schriftliche Einverständniserklärung ab, heißt es in der Erklärung von Helsinki.

Das Studiendesign wird an anderer Stelle ausführlich beschrieben31. Kurz gesagt, in der Hauptstudie (n = 20 gesunde Männer, Durchschnittsalter 25,8 ± 2,5, S01–S20) wurden Urinproben am frühen Morgen um 7:00 Uhr (4,5 Stunden) nach der Verabreichung von GHB/Placebo um 2:30 Uhr entnommen die Experimentiernacht. In einer ersten Pilotstudie wurden GHB/Placebo auf die gleiche Weise verabreicht, jedoch um 23 Uhr der Versuchsnacht. Der Urin des frühen Morgens (n ​​= 20, SP01–SP20) wurde um 7:00 Uhr (8 Stunden) gesammelt. Alle Proben wurden etwa acht Jahre lang bei −80 °C gelagert und maximal zwei Gefrier-Tau-Zyklen unterzogen. Diese Urinproben wurden bereits für frühere ungezielte Metabolomuntersuchungen verwendet17,18.

Die Studienkohorte II wurde aus einer kürzlich durchgeführten klinischen Studie zur Arzneimittelverabreichung an gesunden Freiwilligen (H, n = 21, 6 Männer, 15 Frauen, Durchschnittsalter 27 ± 6,6 Jahre) und Patienten mit schwerer depressiver Störung (P, n = 19, 6 Männer) gewonnen , 13 Frauen, Durchschnittsalter 27 ± 6,9 Jahre). Urinproben, die in der Versuchsnacht am frühen Morgen (4,5 h ± 1 h), am Nachmittag (11 h ± 1 h) und am folgenden Morgen (28 h ± 1 h) entnommen wurden, wurden in die aktuellen GHB-Quantifizierungsexperimente einbezogen . Die Proben wurden bis zur Analyse etwa 6 Monate lang bei –80 °C gelagert und maximal zwei Einfrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Weitere Studiendetails, die sich mit den ursprünglichen Studienzielen befassen, werden an anderer Stelle veröffentlicht.

Die verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel sowie eine detaillierte Beschreibung der validierten LC-MS/MS-Methode finden Sie in Referenz21. Authentische Urinproben (100 µL) wurden mit 10 µL IS-Lösung (GHB-d6 5 µg/ml; Butyrylcarnitin-d3 5 µg/ml) versetzt. Alle Proben wurden mit 500 µL Acetonitril verdünnt, zentrifugiert (14.000 U/min, 15 Min.) und der Überstand in Autosamplerfläschchen überführt. Die Analyse wurde auf einem Shimadzu LC-40Dx3 LC-System (Shimadzu, Duisburg/Deutschland) durchgeführt, das an ein lineares Ionenfallen-Quadrupol-MS Sciex 5500 QTtrap (Sciex, Darmstadt/Deutschland) gekoppelt war und von der Analyst-Software (Version 1.7.2) gesteuert wurde. Kurz gesagt wurde die chromatographische Trennung auf einer SeQuant ZIC-HILIC-Säule (Merck, Darmstadt/Deutschland) nach Gradientenelution durchgeführt. Die Flussrate betrug 0,35 ml/min. Das MS wurde im erweiterten, geplanten Mehrfachreaktionsüberwachungsmodus mit ein bis drei Übergängen pro Analyt betrieben, einschließlich 13C-Isotopen für GHB und GHB-Carnitin. Kalibratoren wurden in synthetischem Urin hergestellt.

Kreatinin wurde durch die Jaffe-Reaktion auf einem Indiko Plus-Gerät (Thermo Scientific, Braunschweig/Deutschland) bestimmt.

Für die Peakintegration und -quantifizierung wurde die MultiQuant-Software (3.0.3, Sciex) verwendet. Die statistische Analyse wurde in GraphPad Prism 7.0 (GraphPad Software, San Diego/CA/USA) durchgeführt. Gruppenvergleiche (Placebo vs. GHB; unterschiedliche Zeitpunkte nach der Einnahme) wurden in den Studienkohorten I und II mit einem einseitigen Mann-Whitney- oder Kruskal-Wallis-Test und anschließendem Dunn-Mehrfachkorrekturtest durchgeführt (p < 0,05). Der Einfluss von Geschlecht und Krankheit wurde mithilfe einer zweifaktoriellen ANOVA mit dem Mehrfachvergleichstest von Sidak bewertet. Wir haben die Korrelation einschließlich des Alters mit der Spearman-Korrelationsanalyse getestet.

Verschiedene Strategien wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, zwischen GHB-Behandlung und endogenen Konzentrationen in der Studienkohorte II zu unterscheiden: (a) Grenzwertkonzentrationen der neuen GHB-Metaboliten, (b) Stoffwechselverhältnisse (MR, Metabolitenkonzentration/GHB-Konzentration) und ( c) erhöhte Peakflächenverhältnisse (Analyt/IS) zwischen zwei Urinproben. Urinproben nach der GHB-Behandlung wurden als Urin 1 und zeitangepasste Placeboproben als Urin 2 entnommen. Ein Datensatz ohne exogenes GHB wurde durch die zeitlich besten Placeboproben nach 4,5 Stunden (Urin 1) oder 28 Stunden (Urin 2) gebildet. . Um die Qualität der Strategien zu beurteilen, werden die Anzahl der wahr-positiven Ergebnisse (TP), falsch-positiven Ergebnisse (FP), wahr-negativen Ergebnisse (TN), falsch-negativen Ergebnisse (FN), resultierende Sensitivität (TP/(TP + FN), Spezifität (TN/ TN + FP) und der positive Vorhersagewert (PPV = TP/(TP + FP)) wurden berechnet.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren danken ihrer Kollegin Maja Keller für ihre Unterstützung und Diskussion und bedanken sich bei Dr. Emma Louise Kessler für ihr großzügiges Vermächtnis, das sie dem Institut für Rechtsmedizin der Universität Zürich, Schweiz, zu Forschungszwecken gespendet hat. Studie II wurde durch ein Projektstipendium des Schweizerischen Nationalfonds (SNF Nr. 175780) finanziell unterstützt, das an ES vergeben wurde.

Abteilung für Forensische Pharmakologie und Toxikologie, Zürcher Institut für Rechtsmedizin, Universität Zürich, Winterthurerstrasse 190/52, 8057, Zürich, Schweiz

Andrea E. Steuer, Dario A. Dornbierer & Thomas Kraemer

Klinik für Psychiatrie, Psychotherapie und Psychosomatik, Psychiatrische Universitätsklinik Zürich, Universität Zürich, 8032, Zürich, Schweiz

Francesco Bavato, Laura K. Schnider, Dario A. Dornbierer, Oliver G. Bosch, Boris B. Quednow & Erich Seifritz

Neurowissenschaftliches Zentrum Zürich, Universität Zürich und Eidgenössische Technische Hochschule Zürich, 8057, Zürich, Schweiz

Boris B. Quednow & Erich Seifritz

Institut für Pharmazeutische Wissenschaften, Eidgenössische Technische Hochschule Zürich, 8093, Zürich, Schweiz

Christian Steuer

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FB, LKS, DAD, OGB, BBQ und ES konzipierten die klinische Studie und die Probensammlung; AES und TK entwarfen den analytischen Aufbau und die Auswertung; AES führte die Analyse und Auswertung der Daten durch; AES hat das Manuskript verfasst; TK, FB und BBQ haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren überprüften das Manuskript und genehmigten die endgültige Fassung.

Korrespondenz mit Andrea E. Steuer.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Steuer, AE, Bavato, F., Schnider, LK et al. Urinkonzentrationen von GHB und seinen neuartigen Aminosäure- und Carnitin-Konjugaten nach kontrollierter GHB-Verabreichung beim Menschen. Sci Rep 13, 8983 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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Eingegangen: 17. Januar 2023

Angenommen: 31. Mai 2023

Veröffentlicht: 02. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36213-1

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