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Apr 30, 2023

Produktion und Charakterisierung von Anthocyanen

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 5863 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Bier ist das drittbeliebteste fermentierte Getränk der Welt. Es wird typischerweise aus gemälzter Gerste hergestellt. Tropische Länder müssen zum Brauen Gerste aus gemäßigten Ländern importieren, was ein teurer Prozess ist. Daher ist es wichtig, alternative mögliche Substrate für die Bierproduktion zu untersuchen, um der wachsenden Nachfrage nach Bier mit hoher Nährwertqualität gerecht zu werden. Die aktuelle Studie umfasst die Herstellung eines fermentierten Getränks aus anthocyanreichem Schwarzweizen mithilfe der Hefe Saccharomyces cerevisiae CMS12, die aus Fruchtabfällen isoliert wurde. Anschließend wurde eine Charakterisierung (UV, HPLC, NMR, FTIR und ICPMS) sowie eine Vergleichsstudie mit weißem (bernsteinfarbenem) Weizenbier durchgeführt. Darüber hinaus umfasste die Optimierung der Prozessparameter die anfängliche Zuckerkonzentration, die Inokulumgröße und den pH-Wert. Schwarze Weizenwürze enthielt einen Gesamtphenolgehalt von 568 mg GAE/L, eine Anthocyankonzentration von 4,67 mg/L, einen Alkoholgehalt von 6,8 % (v/v) und einen pH-Wert von 4,04. Die sensorische Analyse ergab, dass schwarzes Weizenbier akzeptabler war als weißes Weizenbier. Das entwickelte fermentierte Getränk hat ein enormes Kommerzialisierungspotenzial.

Auf der ganzen Welt gibt es zahlreiche Möglichkeiten für fermentierte Lebensmittel und Getränke, und der „Fermentation“-Prozess ist die zugrunde liegende wissenschaftliche Methode zur potenziellen Verbesserung des Nährwerts und der Verdaulichkeit jedes Substrats1. Durch Mikroorganismen erzeugter Geschmack verbessert die sensorische Akzeptanz fermentierter Lebensmittel2. Bier ist nach Wasser und Tee das drittbeliebteste Getränk mit einem weltweiten Konsum von etwa 200 Milliarden Litern pro Jahr. Basierend auf den beim Brauprozess verwendeten Zutaten und Methoden gibt es über 70 verschiedene Biersorten3. Der Alkoholgehalt von Bier liegt zwischen 0,5 Prozent und 15 %4. Bier senkt das Risiko eines Herzstillstands, indem es die Konzentration von Lipiden niedriger Dichte und Homocystein senkt, und fördert die Nierengesundheit5. Bier enthält alle Nährstoffe von Getreidekörnern und Hopfen, reich an Vitamin B, Eiweiß, Mineralien, Ballaststoffen, Phenolen (Antioxidantien), Ethanol und präbiotischen Verbindungen6. Das Aussehen des erzeugten Bieres wird durch den bei der Gärung verwendeten Hefestamm beeinflusst. Die Hefe beeinflusst die Schaumstabilität, die Schaumbildung, die Trübungsbildung und die Bierfarbe7. Da Hefen darüber hinaus Nährstoffe aus der Würze für ihr Wachstum nutzen und die darin enthaltenen Nebenprodukte freisetzen, wirken sich Änderungen in der Würzezusammensetzung direkt auf den Geschmack des Bieres aus8. Die Trübung im Bier ist auf das Vorhandensein von Proteinen, Polysacchariden und Polyphenolen zurückzuführen7. Die aus den Zellwänden der Hefen gewonnenen Mannoproteine ​​tragen dazu bei, die Trübungsbildung zu minimieren und den Schaum zu stabilisieren. Das Enzym Protease wird von Hefen unter ungünstigen Bedingungen ausgeschüttet, wodurch die an der Bildung und Stabilisierung des Bierschaums beteiligten Proteine ​​abgebaut werden. Darüber hinaus können β-Glucanasen, die β-Glucan hydrolysieren, durch autolysierte Hefen freigesetzt werden, was zu einer Verringerung der Viskosität und einem Flüssigkeitsabfluss aus dem Schaum führt9. Bevor mit neuer Hefe zum Brauen experimentiert wird, muss jedoch eine ordnungsgemäße Bewertung durchgeführt werden, da jede Mikrobe einzigartig ist und aufgrund ihrer Wechselwirkung mit verschiedenen Substanzen und Bedingungen Variationen entwickeln kann, die zu verschiedenen Gesundheitsproblemen führen10. Saccharomyces cerevisiae ist die häufigste Hefe in der Brauindustrie11. Bei der Verbindung von Ethanol und Kohlendioxid entstehen zahlreiche Chemikalien wie organische Säuren, Ketone und Ester, die einen erheblichen Einfluss auf den sensorischen Charakter von Bier haben12. Brauer suchen heute nach alternativen, vorteilhafteren Zutaten für die Bierherstellung. Reis, Safran, Weizen, Gerste, Roggen, Mais, Sorghum, Kartoffelhydrolysat und geringe bis mäßige Melasse wurden als Substrate für die Bierproduktion untersucht13,14. Nahrungsmittel mit einem hohen Gehalt an Antioxidantien werden mit gesundheitlichen Vorteilen in Verbindung gebracht, und anthocyanreicher Weizen (Schwarzweizen) ist auch für seine Anti-Adipositas-, blutzuckersenkenden und präbiotischen Eigenschaften bekannt. Somit kann die Bierherstellung aus solchen Rohstoffen den Verbrauchern zusätzliche Vorteile bieten15,16. Die Beliebtheit von aus Weizenmalz hergestelltem Bier schwankte in den letzten Jahren, aber in letzter Zeit ist die Nachfrage nach Weizenbier aufgrund der Einführung neuer Braupraktiken (Handbrauen und Heimbrauen) und der Nichtverfügbarkeit von Gerste in verschiedenen Regionen gestiegen17. Weizen verfügt jedoch nicht über aktive Enzyme, die für die Zuckerproduktion verantwortlich sind. Um diese Enzyme zu aktivieren und sicherzustellen, dass ausreichend Zucker für die Fermentation vorhanden ist, wird Weizen gemälzt. Das Mälzen ist der Hauptschritt des Brauprozesses. Der Zweck des Mälzens besteht darin, die Produktion von 11 hydrolytischen Enzymen im Getreide zu fördern3. Unter den zahlreichen Weizensorten ist Schwarzweizen eine Hybridpflanze, die durch Kreuzung von Purpurweizen und Blauweizen hergestellt wird und als potenzielles Substrat für die Bierproduktion dienen kann. Dieser Weizen ist sehr reich an Anthocyanen, Proteinen, Ballaststoffen und anderen Nährstoffen usw.18. Die aktuelle Studie nutzte den biotechnologisch entwickelten Schwarzweizen als Substrat zur Herstellung von anthocyanreichem Bier aus dem frisch isolierten Stamm Saccharomyces cerevisiae CMS12. In dieser Arbeit wurde bei der Bierherstellung kein Hopfen verwendet, sodass der Gehalt an Antioxidantien und die Farbe vom schwarzen Weizen selbst stammen. Das mit schwarzem Weizenmalz gebraute Bier wurde mit dem mit weißem Weizenmalz gebrauten Bier verglichen. Darüber hinaus wurde das Bier mittels UV, HPLC, NMR, FTIR, ICPMS und einem Farbwert charakterisiert. Nach unserem besten Wissen über die vorhandene Literatur wurden keine früheren Arbeiten zur Herstellung von anthocyanreichem Bier aus schwarzem Weizen veröffentlicht. In dieser Studie werden die physikalisch-chemischen Eigenschaften und das sensorische Profil von Schwarzweizen als Substrat für die Bierherstellung bewertet.

Für die Bierzubereitung wurden zwei Weizensorten verwendet, nämlich Weiß (cv C306) und Schwarz (NABIMG-11; Ref. 19), die im April 2022 auf dem Gebiet des National Agri-Food Biotechnology Institute, Mohali, Indien, angebaut wurden. Zunächst wurden beide Weizensorten mit 60 % relativer Luftfeuchtigkeit oberflächensterilisiert mit Natriumhypochlorit und dann bis zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Die mikrobiellen Medienbestandteile wurden von HiMedia Laboratories, Mumbai, Indien, bezogen. Als Kontrollhefe wurde Saccharomyces cerevisiae von der Fermentis Company in Lesaffre, Frankreich, gekauft. Reagenzien, Indikatoren, Lösungsmittel, Enzyme und Chemikalien in analytischer Qualität wurden bei Merck, Sigma Aldrich, USA, bestellt. Für alle Experimente wurden Borosilikatglasgeräte und bidestilliertes Wasser verwendet.

Proben von Fruchtnebenprodukten (Apfel, Weintrauben und Banane) wurden in sterilen Behältern gesammelt und bei 4 °C gekühlt, bis sie zur Isolierung von Ethanol produzierenden Hefen verwendet wurden. Die Isolierung erfolgte durch Reihenverdünnungen bis zu 10–6 unter Verwendung der Ausbreitungsplattenmethode und Glucose-Hefeextrakt-Agarplatten (GYE) für 48 Stunden bei 30 °C. Die gewünschten Isolate wurden anhand ihres Potenzials zur Ethanolproduktion analysiert und mittels HPLC ausgewählt. Die Kolonien wurden in einen 250-ml-Kolben mit 50 ml GYE-Brühe gegeben und zur Ethanolproduktion bei 28 °C und 150 U/min gehalten20. Die Proben wurden über einen Zeitraum von 6 Stunden gesammelt und mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Agilent, HiPlex, Kalifornien, USA) mit einem auf 55 °C eingestellten RID-Detektor und einer Agilent HiPlex H-Säule (300 mm × 7,7 mm) analysiert , 8 m) auf 60 °C eingestellt. Die Flussrate der mobilen Phase (5 mM H2SO4) betrug 0,7 ml/min. Vor der HPLC wurde die mobile Phase entgast und durch einen 0,22 µm Nylonmembranfilter (Millipore, MA) filtriert. Die Hefe mit der höchsten Ethanolausbeute unter mesophilen Bedingungen wurde ausgewählt. Mit einem Umkehrlichtmikroskop (40fach) wurde die Morphologie vielversprechender Stämme untersucht (Nikon Eclipse TS2, USA) und die Kultur wurde in einer Einrichtung des Institute of Microbial Technology in Chandigarh identifiziert.

Fermentationsparameter wie Substratkonzentration (Glukose) (40–80 g/l), Inokulumgröße (2–12 %) und pH-Wert (4,5–7) wurden mithilfe des One-Factor-at-a-Time (OFAT) überprüft. Technik zur Maximierung der Ethanolproduktion durch isolierte Hefestämme aus Fruchtabfällen. Alle Versuche wurden bei 28 °C unter mikroaerophilen Bedingungen unter Schütteln bei 150 U/min21 durchgeführt. Die Brühe wurde nach Zentrifugation (6000 U/min, 10 Min.) gewonnen und Restzucker und Ethanol wurden mittels HPLC gemessen.

Malz wurde durch Einweichen, Keimen und Darren von Weizenkörnern hergestellt22. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass 250 g Weizen 6 Stunden lang bei 16 °C in 1000 ml Wasser eingeweicht wurden, um den Feuchtigkeitsgehalt von 12 auf 40 % zu erhöhen. Zwei Tage lang wurden die Körner mit Keimpapier abgedeckt und bei Raumtemperatur belassen. Aus den gekeimten Körnern wurde im Ofen Schrot hergestellt, der dann zerstampft wurde. Das Schrot wurde mit entionisiertem Wasser (Wasser:Schrot) im Verhältnis 3:1 zerstampft und bei einer Geschwindigkeit von 150 U/min gemischt, bevor es 1 Stunde lang auf 45 °C erhitzt wurde. Unter konstantem Mischen bei 150 U/min wurde die Temperatur 15 Minuten lang auf 52 °C, 45 Minuten lang auf 65 °C und 15 Minuten lang auf 75 °C erhöht. Nach dem Maischen wurde das Filtrat 20 Minuten lang bei 10.000 U/min zentrifugiert und 30 Minuten lang bei 100 °C23 gekocht. Die abgekühlten Niederschläge wurden durch Filterpapier filtriert und das Filtrat (Würze) vergoren.

Bei 28 °C wurden die Hefen 24 Stunden lang auf GYE-Agarplatten kultiviert. Vor der Fermentation wurde eine Kolonieschleife in 50 ml Medium (GYE-Brühe) in einem 250-ml-Kolben eingeführt. 24 Stunden lang bei 28 °C in einem Schüttler (Innova42, New Brunswick Scientific, CT, USA) bei 150 U/min22 inkubieren.

Fermentationsversuche wurden mit 50 ml Würze in 250-ml-Kolben durchgeführt. Das Fermentationsmedium wurde mit einem 24 Stunden alten Hefe-Inokulum beimpft und 120 Stunden23 lang bei 28 °C und 150 U/min gehalten. Nachdem der Fermentationsprozess abgeschlossen war, wurden die Zellen der Brühe durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 6000 U/min21 abgetrennt. Der Zuckerverbrauch (Glukose, Maltose) und die Ethanolbildung wurden durch regelmäßige Probenentnahme alle 6 Stunden überwacht und mittels HPLC analysiert.

Untersuchung der Kinetik von zubereitetem schwarzem Weizenbier mithilfe eines nichtlinearen Regressionsmodells und des Tools „LABFIT“ (V 7.2.50, Campina Grande, Brasilien). Das 95 %-Konfidenzintervall wurde verwendet, um die Vorhersagen des Logistikmodells mit experimentellen Produktionsraten (CI) zu vergleichen. Die kinetischen Faktoren a, b und c zur Herstellung von schwarzem Weizenbier wurden ebenfalls berechnet.

Das Bier wurde in 2-Liter-Chargen hergestellt und seine physikalisch-chemischen und organoleptischen Eigenschaften untersucht. Unter den gleichen Bedingungen wurde 1 kg Weizen (schwarz und weiß) zur Malzherstellung verwendet. HPLC wurde verwendet, um den Zucker- und Ethanolgehalt während der Fermentation zu bestimmen. Das Bier wurde gekühlt, nachdem es 30 Minuten lang bei 63 °C pasteurisiert wurde. Halbgeschulte Fachkräfte (n = 9) von Mohali, Indiens Zentrum für innovative und angewandte Bioverarbeitung, bewerteten die sensorischen Parameter von Bier auf einer neunstufigen hedonischen Skala hinsichtlich Aussehen, Geschmack, Farbe, Aroma und Gesamtakzeptanz24,25. Wohingegen 9 „mag sehr“, 8 „mag sehr“, 7 „mag mäßig“, 6 „mag wenig“, 5 „mag keines“, 4 – „mag nicht“, 3 „mag mäßig nicht“, 2 „mag sehr nicht“ und 1 – gefällt „extrem“.

Der pH-Wert (pH-Meter, Mettler Toledo, Mumbai, Indien), die gesamten löslichen Feststoffe (TSS) und der titrierbare Säuregehalt der vorbereiteten Bierproben wurden bestimmt26. HPLC wurde verwendet, um die Menge an Ethanol und Zucker zu bestimmen. Zur Untersuchung der Mineralien wurde die Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) verwendet (7800 ICP MS, Agilent Technologies, USA). Der Gesamtphenolgehalt wurde unter Verwendung der Methode von Kumari et al.27 bei 650 nm mit einem Spektrophotometer (UV3000 +, Lab India, Delhi, Indien) bestimmt. Der Gesamtgehalt an monomeren Anthocyanen (TMA) wurde mit zwei verschiedenen Wellenlängen von 520 und 700 nm28 bestimmt. Die Farbe wurde mit EBC-Geräten (European Brewing Convention) bei 430 nm29 bestimmt.

Die Proben wurden in deuteriertem Dichlormethan in vollständig trockenen 5-mm-NMR-Röhrchen gelöst. Für die NMR-Spektroskopie wurden die Proben vor der Analyse 10 Minuten lang im Ultraschallgerät entgast. Als interner Standard wurde Tetramethylsilan verwendet30. Zur Charakterisierung organischer Moleküle wurden Messungen mit einer Relaxationsverzögerung von 6 s in einem Bruker Advance 300-Spektrometer bei einer Magnetfeldstärke von 400 MHz28 durchgeführt.

Die Proben wurden mithilfe einer FTIR-Analyse in Verbindung mit einer ATR-Analyse (Agilent-Modell: Cary 660-Serie) mit einem Maßstab von 4000–600 cm−1 und einer Variation von 4 cm−1 analysiert, um die Änderung der chemischen Struktur zu quantifizieren. Zur Messung des Hintergrunds der Proben wurde eine leere ATR-Zelle verwendet. Um schwarze und weiße Weizenbiere zu vergleichen, wurde die Absorptionsstärke jedes Spektrums beobachtet.

Zur quantitativen Messung der während des Produktionsprozesses anfallenden Monosaccharide und Ethanol wurde Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) (Agilent, HiPlex, Santa Clara, Kalifornien, USA) verwendet. Zur Bestimmung wurde ein Brechungsindexdetektor (RID) bei 55 °C verwendet. Die mobile Phase war 5 mM H2SO4 mit einer Flussrate von 0,7 ml/min in einer Agilent HiPlex H-Analysesäule (300 mm 7,7 mm, 8 m), die bei 60 °C betrieben wurde.

Von jeder Probe wurde ein Dreifachversuch durchgeführt. Zur Darstellung aussagekräftiger Ergebnisse werden der Mittelwert und die Standardabweichung der Datenwerte verwendet. Die Daten wurden einer Varianzanalyse mittels ANOVA mit statistischer Signifikanz (P < 0,05) unterzogen und mithilfe des LSD-Tests (Least Significant Difference) verglichen. Zur Darstellung der Ergebnisse wird ein Signifikanzniveau von p-Wert < 0,05 verwendet. Alle statistischen Analysen wurden mit Software (IBM-SPSS, Version-28, Armonk, New York (NY), USA) durchgeführt.

Die Sammlung und Verwendung der Pflanzen entsprach allen relevanten Richtlinien des National Agri-Food Biotechnology Institute (NABI), Mohali.

Aus den 25 gescreenten Isolaten wurden zwei potenzielle Hefen mit der Bezeichnung C1 und C2 aufgrund ihrer Fähigkeit, die gewünschte Ethanolausbeute zu erzielen, ausgewählt. Auf einer Agarplatte bildeten beide Isolate (C1 und C2) kleine cremeweiße Kolonien (~ 5 mm), die erhaben und kreisförmig waren. Die unter einem 40-fachen Mikroskop beobachteten Zellen hatten eine eiförmige Form und zeigten Anzeichen von Knospung, wie in der ergänzenden Abbildung B dargestellt. Die mit der GenBank-Datenbank analysierte Sequenz der D1/D2-Domäne von 26S-rRNA und 5,8S-ITS-rDNA zeigte eine evolutionäre Beziehung zu anderen eng verwandte Saccharomyces cerevisiae-Stämme und 100 % Homologie mit Saccharomyces cerevisiae NRRLY-12632NT (AY046146), mit dem der Test einen gemeinsamen Vorfahren hat. Daher wurde der Stamm C2 nach der taxonomischen Identifizierung durch seine wissenschaftliche Nominierung zusammen mit dem Laborcode als Saccharomyces cerevisiae CMS12 benannt (Abb. 1). In ähnlicher Weise wurde der Stamm C1 als Saccharomyces cerevisiae CMS 11 identifiziert. Die morphologischen Eigenschaften isolierter Hefen waren die gleichen wie die, die für isolierte Saccharomyces cerevisiae aus Zuckerrohrmelasse beobachtet wurden31. In dieser Studie wurden beide identifizierten Stämme zur leichteren Bezugnahme als C1 und C2 bezeichnet.

Phylogenetischer Baum basierend auf ITS- und D1/D2-Gensequenzvergleich, der die Position von S. cerevisiae CMS12 und anderen verwandten Arten der Gattung Saccharomyces zeigt.

Die gescreenten und isolierten Hefestämme (C1 und C2) wurden optimiert, um Ethanol auf synthetischen Medien zu produzieren, wie schematisch in der ergänzenden Abbildung A dargestellt. Abbildung 2a zeigt, dass die Ethanolproduktion mit steigender Zuckerkonzentration abnimmt, was auf den Anstieg des osmotischen Drucks zurückzuführen ist und die Oxidation unterdrückt Wege. Bei niedrigen Substratkonzentrationen hingegen verhungerte die Hefe und die Produktion ging zurück14,32.

Optimierung der Fermentationsprozessparameter unter Verwendung des Kontrollstamms und der in dieser Studie isolierten Stämme (C1, C2) (a) Glukosekonzentration (b) Temperatur (c) Inokulumgröße (d) pH-Wert. C1: Saccharomyces cerevisiae CMS11; C2: Saccharomyces cerevisiae CMS12; Kontrolle: kommerzielle Kultur von Saccharomyces cerevisiae.

Eine Inokulumgröße von 10 % v/v für C1 und 8 % für C2 ergab eine Ethanolumwandlungseffizienz von 50 % bzw. 47 % aus dem Substrat. Im Vergleich zu Kontrollhefe mit einer Inokulumgröße von 12 % oder 10 % v/v wurde kein signifikanter Unterschied in der Effizienz der Ethanolumwandlung beobachtet (Abb. 2b). Daher wurde für weitere Untersuchungen eine Inokulumgröße von 10 % festgelegt. Wilkins et al.33 produzierten optimiertes Ethanol unter Verwendung von Saccharomyces cerevisiae mit 10 % v/v Inokulum in einer 72-stündigen Fermentation. Eine Erhöhung der Inokulumgröße verbesserte die Fermentation nicht, da sie, wie bereits berichtet, zur Erschöpfung des Substrats führte34.

Die isolierten Hefestämme führten zu einer optimalen Ethanolproduktion bei pH 5,5. Die Produktion nahm mit steigendem pH-Wert (6,5) ab (Abb. 2c). Daher wurde ein pH-Wert von 5,5 als optimal für die C1- und C2-Stämme für die Ethanolproduktion angesehen, wie bereits berichtet35.

Die Temperatur beeinflusst das Hefewachstum und den Gehalt an flüchtigen organischen Stoffen. Bei 28 °C sind Hefewachstum und Alkoholproduktion schneller als bei niedrigeren Temperaturen. Sowohl C1 als auch C2 zeigten ähnliche Beobachtungen (Abb. 2d). Daher wurden 28 °C als optimal erachtet. Frühere Beobachtungen waren ähnlich36.

Bei der Fermentation der Schwarzweizenwürze erfolgte der Glukoseverbrauch wesentlich schneller als der Maltoseverbrauch. Während der ersten 8 Stunden der Fermentation verdaut der C2-Hefestamm die Glukose vollständig und zeigte eine maximale Ethanolproduktion (71,98 g/l), die höher war als die der Standardhefe (Abb. 3a–c). Nach 48 Stunden Fermentation nahm die Maltosekonzentration allmählich ab, bis sie vollständig erschöpft war.

Zeitrafferänderungen der Maltose-, Glucose- und Ethanolkonzentrationen von Schwarzweizenwürze nach der Fermentation mit verschiedenen Hefestämmen (a) Standardhefe (Saccharomyces cerevisiae) als Kontrolle (b) Stamm C1 und (c) Stamm C2 (d) Kinetische Modellierung von potentieller Stamm C2.

Mit der Anwendung des Logistikmodells37 für die Bierproduktion und C2 als potenzielle Belastung. Die Kurve passte mit einem Konfidenzintervall von 95 % eng zum projizierten Band. R2 = 0,99 (Abb. 3d).

Extrapolierte die kinetischen Parameter aus der folgenden Gleichung:

P = a/{1 + b exp (c*x)}.wobei P = Ethanolproduktion (g/L), a = Maximale Ethanolkonzentration = 71,95 ± 02 g/L, b = Fermentationszeit = 42,2 ± 0,2 h, c = Umwandlungsrate = 1,67 ± 0,1 g/Lh.

Statistisch signifikante Werte wurden durch den einfaktoriellen ANOVA-Test mit einem ap-Wert < 0,05 identifiziert.

Das als Kontrolle genommene schwarze Weizenbier, das aus dem kommerziellen Hefestamm S. cerevisiae hergestellt wurde, zeigte einen höheren pH-Wert (4,7) als beide isolierten Stämme. Der C1-Stamm produzierte Bier mit dem geringsten Säuregehalt (0,12) und pH-Wert (4,0). Der C2-Stamm produzierte Bier mit einem Säuregehalt (0,28) und einem niedrigen pH-Wert (4,0). Allerdings produzierte das schwarze Weizenbier der Sorte C2 einen höheren Alkoholgehalt als andere. Der C1-Stamm enthielt 6,52 % Alkohol (v/v), während die C2- und Kontrollstämme 7 % bzw. 6,41 % Alkohol enthielten (Tabelle 1). Aus der veröffentlichten Literatur geht hervor, dass Biere aus verschiedenen Malzen 3,50–12 % Alkohol, einen pH-Wert von 4,0–5,0 und einen Säuregehalt von 0,1–0,3 haben38,39. Die beobachteten Daten stimmen mit der veröffentlichten Literatur überein. Das aus drei Sorten hergestellte Bier zeigte jedoch eine ähnliche Farbe. Die Farbanalyse von gebrautem schwarzem Weizenbier mit C1-, C2- und Kontrollhefe ergab 22,95, 21,45 bzw. 22,72 EBC. Die Farbe ist auf Anthocyane zurückzuführen (Abb. 4I), wie bei Früchten mit einer Farbe von ~ 25,8 EBC40 berichtet wird. Während bei isolierten Stämmen im Vergleich zur Kontrolle ein erhöhter Phenolgehalt beobachtet wurde, ist der C2-Stamm am höchsten. Es betrug 609,37, 613,12 und 568,00 mg GAE/L in C1-, C2- und Kontrollbier. Das Ale-Bier hat 563 mg GAE/L41. Biere mit hohem Phenolgehalt haben eine längere Haltbarkeit, einen besseren Geschmack und Duft als Biere mit niedrigem Phenolgehalt42.

(I) FTIR von (a) weißem Weizenbier und (b) schwarzem Weizenbier, (II) UV-Spektren, die Anthocyane in der schwarzen Weizenbierproduktion unter Verwendung von C1-, C2- und Kontrollhefestämmen zeigen.

Der Gesamtgehalt an Monomer-Anthocyanen (TMA) der Würze vor und nach dem Kochen betrug 10,52 mg/L bzw. 7,85 mg/L. Dieser Rückgang kann auf die Hitzeempfindlichkeit der Anthocyane zurückzuführen sein43. Der TMA in schwarzem Weizenbier mit isolierten Stämmen war höher als bei der Kontrolle und am höchsten beim C2-Stamm. Der TMA für C1, C2 und Kontrollhefe betrug 5,67, 6,43 bzw. 4,67 mg/L. Die Aufnahme von Anthocyanen durch Hefen während der Fermentation kann die Ergebnisse beeinflussen. Ähnliche Beobachtungen wurden bereits früher für schwarze Reiswürze gemeldet44. Da das vom Stamm C2 produzierte Bier die höchste Alkoholproduktion sowie den höchsten Phenol- und Anthocyangehalt aufwies, wurde es für weitere Experimente ausgewählt. Die in unserer Arbeit ermittelte endgültige Anthocyanausbeute und der Alkoholgehalt waren höher als in der Studie zur Bierproduktion unter Verwendung von Süßkartoffeln durch Saccharomyces cerevisiae, die Bier mit einem pH-Wert von 3,5, 5,10 mg/100 ml Anthocyan und einem Alkoholgehalt von 3,77 % produzierte39. Eine weitere Studie von Piraine et al.45 unter Verwendung von S. cerevisiae WLP001-Bier mit einem pH-Wert von 4,30 und einem Alkoholgehalt von 3,57 %. Auch der niedrige pH-Wert des Stamms C2 deutete auf seine Anwendbarkeit bei der Herstellung von sauren Bieren hin. In einer anderen Studie wurde ein Ethanolgehalt von 5,37 % (v/v) bei S. cerevisiae-fermentiertem Bier mit Lubelski-Hopfen und 5,22 % (v/v) bei Bier mit Marynka-Hopfen46 berichtet. In einigen Studien gelang es jedoch auch, den Alkoholgehalt auf bis zu 9,6–10,46 % zu steigern, indem während des Fermentationsprozesses geeignete Bedingungen geschaffen und die Fermentationsmedien optimiert wurden47. Das bedeutet, dass der Alkoholgehalt neben dem Potenzial der Sorte auch von den verwendeten Hopfenarten abhängt. Unter dem Gesichtspunkt der Verwendung von Stämmen in der Brauindustrie ist jedoch die Beständigkeit gegenüber einer höheren Ethanolkonzentration im Gegensatz zum produzierten Ethanolanteil nicht das Hauptkriterium.

Es wurden schwarzes Weizenbier und weißes Weizenbier im 2-Liter-Maßstab hergestellt. Bei schwarzem Weizenbier wurden im Vergleich zu weißem Weizenbier bessere physikalisch-chemische Eigenschaften beobachtet, einschließlich Alkoholgehalt, EBC und Säure (Tabelle 2). Die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Bieres beeinflussen die Verbraucherakzeptanz. Die in Tabelle 3 dargestellten Daten stellen die mittlere sensorische Bewertung dar, einschließlich Aussehen/Farbe, Geschmack, Aroma und Gesamtakzeptanz. Die Gesamtakzeptanz für schwarzes Weizenbier war etwas höher als für weißes Weizenbier. Auffällig war die Farbvariation der Biere; Das schwarze Weizenbier hat eine orangerote Farbe, während das weiße Weizenbier eine blassgoldene Farbe hat. Bei den Mineralstoffgehalten (Ergänzungstabelle A) waren Kalium und Magnesium höher (1661,17 ppm bzw. 486,50 ppm im schwarzen Weizenbier) als im Kontrollweißbier (526,13 ppm bzw. 126,80 ppm). Darüber hinaus waren Kalzium und Zink in schwarzem Weizenbier ebenfalls höher (20,97 ppm bzw. 1,62 ppm) als in weißem Weizenbier (8,33 ppm bzw. 0,22 ppm)48.

Der Teil des Spektrums unter 1500 cm−1 lässt sich nur schwer mit einer bestimmten molekularen Schwingung in einer so komplexen Mischung wie Bier in Verbindung bringen, da jedes Molekül in diesem Bereich des Spektrums ein eigenes Absorptionsmuster erzeugt. Aufgrund des Dextrins wurde jedoch eine CO-Streckung beobachtet, die in schwarzem Weizenbier bei 1007 cm−1 und in weißem Weizenbier bei 1014 cm−1 liegt. Eine Reihe von Spektralbanden unterhalb von 1500 cm−1 entsprechen der Schwingung von C–C- und Hydroxylgruppen in Kohlenhydraten und Ethanol. Sowohl in Weiß- als auch in Schwarzweizenbieren wird das Ethanol bei ~ 2919 cm−1 absorbiert; Diese Wellenlänge ähnelt der asymmetrischen Streckbande der Methylgruppe. Dagegen wurde die O-H-Streckung in beiden Bieren im Bereich der Bande 3200 cm−1–3300 cm−1 beobachtet, da Wasser- und Ethanolmoleküle Wasserstoffbrückenbindungen miteinander bilden können. Der Bandbereich von 1600 cm−1 bis 1900 cm−1 ist mit der Streckung C = O49 gekennzeichnet und hängt mit den unzähligen verschiedenen chemischen Komponenten zusammen, die im Bier enthalten sind, wie z. B. Vitamine und lösliche gelöste Stoffe50.

UV-Vis-Spektroskopie wird häufig zur Identifizierung von Anthocyanen eingesetzt. Bei sorgfältiger Analyse kann das Spektrum Aufschluss darüber geben, wie Anthocyane zusammengesetzt sind. Vor allem die UV-Vis-Daten sind immer noch nützlich, um die allgemeine Struktur von Anthocyanen zu bestätigen und die ungesättigten und funktionellen Gruppen in den verschiedenen Teilen der Anthocyanstruktur zu beschreiben. Im Allgemeinen zeigen Anthocyane ein typisches Absorptionsmuster im UV-Vis-Spektrum, wie in Abb. 4II dargestellt. Meistens liegt das Absorptionsmaximum (λmax) im sichtbaren Bereich zwischen 510 und 520 nm, gefolgt von einer Kurve zwischen 400 und 450 nm. Es ist leicht zu erkennen, dass C1, C2 und die Kontrolle Anthocyane in ihren UV-Vis-Spektren enthalten. Ein Buckel ist auch zwischen 400 und 450 nm zu sehen, gefolgt von einem Muster im sichtbaren Bereich von 500–600 nm. Die Größe dieses Höckers hängt davon ab, wie viele Zuckermoleküle an die Anthocyanidin-Einheit gebunden sind. Im Allgemeinen weist die Struktur von Anthocyan ein vollständig delokalisiertes konjugiertes System auf, das es stabil macht. Frühere Studien haben gezeigt, dass Anthocyane einem ähnlichen Muster folgen51.

1H-NMR-Spektren von schwarzem Weizen- und weißem Weizenbier sind in Abb. 5 dargestellt. Insgesamt wurden ähnliche Peakmuster sowohl im schwarzen als auch im weißen Weizenbier beobachtet. Der stark reagierende Bereich in der Nähe von etwa 3,5 ppm stellt hingegen die organischen Säuren wie Zitronensäure, Bernsteinsäure, Brenztraubensäure und Essigsäure in beiden Proben dar52. Darüber hinaus wurden im Spektrum Dextrine und Zucker bei 5 ppm beobachtet53. Insgesamt wurden ähnliche Spitzenmuster sowohl beim schwarzen als auch beim weißen Weizenbier zusammen mit der berichteten Literatur beobachtet30,52.

NMR von (a) weißem Weizenbier und (b) schwarzem Weizenbier.

Brauer suchen nach Möglichkeiten, ihre Produkte lukrativer zu machen, da die Nachfrage nach Bier weiter steigt. Die Ergebnisse dieser Studie legen nahe, dass es möglich ist, aus schwarzem Weizen mit hohem Anthocyan- und Mineralstoffgehalt ein neues Bier herzustellen. Der isolierte Stamm C2 (Saccharomyces cerevisiae CMS12) produzierte schwarzes Weizenbier mit höheren Gehalten an Alkohol (7 % v/v) und Anthocyanbestandteilen (6,43 mg/L). Laut sensorischer Beurteilung hatte schwarzes Weizenbier eine höhere Akzeptanz als weißes Weizenbier. Allerdings ist das entwickelte Schwarzweizenbier nicht nur von Natur aus reich an Nährstoffen, sondern auch eine reiche Quelle an Anthocyanen und hat das Potenzial, mehrere direkte und indirekte gesundheitliche Vorteile zu bieten. Es sollte jedoch in Maßen und verantwortungsvoll konsumiert werden, da ein Übermaß schlecht ist. Als fermentiertes Getränk verfügt das neu entwickelte schwarze Weizenbier über erhebliches Marktpotenzial.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Autoren möchten dem Center of Innovative and Applied Bioprocessing (DBT-CIAB), Department of Biotechnology (DBT), ihren Dank aussprechen, das während dieser Forschungsstudie Unterstützung und Motivation geboten hat. Die Autoren möchten außerdem allen Forschern und Mitarbeitern des CIAB für ihre Unterstützung und Zusammenarbeit im Verlauf der Studie danken.

Zentrum für innovative und angewandte Bioverarbeitung (CIAB), Sektor 81, Mohali, 140306, Indien

Arshpreet Singh, Saumya Singh und Meena Krishania

Dr. SS Bhatnagar University Institute of Chemical Engineering and Technology, Panjab University, Chandigarh, Indien

Arshpreet Singh & Sushil K. Kansal

National Agri-Food Biotechnology Institute (NABI), Sektor 81, Mohali, 140306, Indien

Monika Garg

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Erklärung der Kreditautoren AS: Methodik, Validierung, Verfassen des Originalentwurfs SS: Datenkuration, Validierung, Verfassen des Originalentwurfs SKK: Überwachung, formale Analyse, Visualisierung, Untersuchung MG: Überwachung, Untersuchung, Datenkuration, Validierung, Visualisierung, MK: Konzeptualisierung , Untersuchung, Projektverwaltung, Überwachung, Visualisierung, Schreiben, Überprüfen und Bearbeiten.

Korrespondenz mit Meena Krishania.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Singh, A., Singh, S., Kansal, SK et al. Herstellung und Charakterisierung von Anthocyan-reichem Bier aus Schwarzweizen durch ein effizientes Isolat Saccharomyces cerevisiae CMS12. Sci Rep 13, 5863 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-32687-1

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Eingegangen: 07. Februar 2023

Angenommen: 31. März 2023

Veröffentlicht: 11. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-32687-1

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