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May 16, 2023

Potenzial des CRISPR/Cas-Systems als neue Instrumente zur Erkennung einer Virushepatitis-Infektion

Virologie-Journal

Virology Journal Band 20, Artikelnummer: 91 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Virushepatitis, die häufigste Ursache einer entzündlichen Lebererkrankung, betrifft weltweit Hunderte Millionen Menschen. Am häufigsten wird es mit einem der fünf nominellen Hepatitisviren (Hepatitis-A-E-Viren) in Verbindung gebracht. HBV und HCV können akute Infektionen und lebenslange, anhaltende chronische Infektionen verursachen, während HAV und HEV selbstlimitierende akute Infektionen verursachen. HAV und HEV werden überwiegend fäkal-oral übertragen, während die durch die anderen Formen übertragenen Krankheiten durch Blut übertragen werden. Trotz der Erfolge bei der Behandlung der Virushepatitis und der Entwicklung von HAV- und HBV-Impfstoffen gibt es für diese Krankheiten noch immer keine genaue Diagnose auf genetischer Ebene. Die rechtzeitige Diagnose einer Virushepatitis ist Voraussetzung für eine wirksame therapeutische Intervention. Aufgrund der Spezifität und Empfindlichkeit der Technologie „Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeat“ (CRISPR)/CRISPR-assoziierte Sequenzen (Cas) hat sie das Potenzial, kritische Anforderungen im Bereich der Diagnose von Viruserkrankungen zu erfüllen und kann in vielseitigen Punkt- of-care (POC)-Diagnoseanwendungen zum Nachweis von Viren mit DNA- und RNA-Genomen. In diesem Aufsatz diskutieren wir die jüngsten Fortschritte bei CRISPR-Cas-Diagnosetools und bewerten deren Potenzial und Aussichten für schnelle und wirksame Strategien zur Diagnose und Kontrolle einer Virushepatitis-Infektion.

Virushepatitis, eine Infektion, die eine Leberentzündung verursacht, ist ein erhebliches globales Gesundheitsproblem. Es gibt zahlreiche Viren, von denen bekannt ist, dass sie Leberentzündungen verursachen, darunter das Herpes-simplex-Virus (HSV), das Zytomegalievirus (CMV), das Epstein-Barr-Virus (EBV) und das Varicella-Zoster-Virus (VZV) [1]. Die häufigsten Erreger dieser Erkrankung sind jedoch hepatotrope Viren, darunter das Hepatitis-A-Virus (HAV), das Hepatitis-B-Virus (HBV), das Hepatitis-C-Virus (HCV), das Hepatitis-Delta-Virus (HDV) und das Hepatitis-E-Virus (HEV). ), die entweder zu einer akuten oder einer chronischen Infektion führen [2]. Zu diesen Leberviren gehören eine Vielzahl von DNA- und RNA-Viren aus verschiedenen Virusfamilien, die über unterschiedliche Übertragungswege verbreitet werden [3]. Weltweit verursacht Virushepatitis jedes Jahr etwa 1,4 Millionen Todesfälle. In Bezug auf die Sterblichkeit zählen HBV und HCV zu den vier größten Infektionsbedrohungen weltweit, gleichauf mit HIV, Malaria und Tuberkulose [4, 5]. Die klinischen Symptome einer Virushepatitis variieren von Symptomen wie asymptomatischer Hepatitis bis hin zu akuter Hepatitis, akutem Leberversagen, chronischer Lebererkrankung und sogar der Entwicklung leberbedingter Folgen, einschließlich hepatozellulärem Karzinom (HCC) bei verschiedenen Patienten [6]. Trotz einiger medizinischer Fortschritte in der Hepatitis-Therapie und der Entwicklung von HAV- und HBV-Impfstoffen besteht immer noch eine große Lücke in der genauen genetischen Diagnose von Virushepatitis-Infektionen. Eine frühzeitige und genaue Diagnose einer Virushepatitis und eine frühzeitige Bewertung ihrer Prognose sind entscheidend für die wirksame Behandlung und Pflege betroffener Menschen [7]. Die neue Gen-Editing-Technologie CRISPR/Cas hat das Potenzial, diese technischen Lücken zu schließen. Das CRISPR/Cas-System ist für ein breites Spektrum diagnostischer und therapeutischer Anwendungen mit hoher Effizienz und programmierbaren Designs attraktiv [8]. CRISPR-Loci wurden erstmals 1987 in E. coli entdeckt, gefolgt von der Identifizierung von CRISPR-abhängigen Proteinen. Nachfolgende Untersuchungen haben gezeigt, dass CRISPR in prokaryotischen Zellen als Abwehrmechanismus gegen exogene genetische Elemente, einschließlich viraler Krankheitserreger und Plasmide, durch präzisen und spezifischen Abbau ihrer Sequenzen dient [9, 10]. Das CRISPR-Cas-System ist in zwei Hauptkategorien unterteilt, Klasse I und II, die sechs Typen und achtundvierzig Subtypen umfassen [11]. Klasse I umfasst die Typen I, III und IV, die mit den Enzymen Cas3, Cas10 bzw. Cas8-like (csf1) assoziiert sind und CRISPR-RNA (crRNA) zusammen mit einer Reihe von Cas-Proteinen verwenden, um diese zu identifizieren und zu eliminieren gezielte genetische Elemente. Klasse II des CRISPR-Systems umfasst die Typen II, V und VI, die die Proteine ​​Cas9, Cas12 bzw. Cas13 enthalten und für ihre Funktion crRNA und nur ein Multidomänen-Cas-Protein verwenden [12,13,14,15, 16]. In diesem Aufsatz untersuchen wir die jüngsten Fortschritte bei CRISPR-Cas-Diagnosetools und ihre möglichen Anwendungen bei der Erkennung von Virushepatitis-Infektionen. Zunächst geben wir einen kurzen Überblick über die fünf Hauptklassifikationen von Hepatitisviren und ihre klinischen Aspekte. In den folgenden Abschnitten skizzieren wir die Bedeutung und Anwendungen des CRISPR-Cas-Systems für die Diagnostik von Infektionskrankheiten, wobei wir uns hauptsächlich auf verschiedene CRISPR-Cas-Effektoren für den Nachweis von Virushepatitis konzentrieren. Darüber hinaus werden wir die Vor- und Nachteile CRISPR-basierter Diagnosesysteme ausführlich erläutern und zukünftige Forschungsperspektiven vorstellen.

Virushepatitis ist eine der häufigsten Ursachen für Morbidität und Mortalität beim Menschen, sowohl aufgrund einer akuten Infektion als auch aufgrund chronischer Komplikationen [17, 18]. Obwohl alle fünf Hepatitisviren hauptsächlich die Leber infizieren, werden sie in verschiedene Virusfamilien eingeteilt und unterscheiden sich hinsichtlich Struktur, Genom und Lebenszyklus völlig voneinander [19]. HAV und HEV werden normalerweise über den fäkal-oralen Weg von Mensch zu Mensch übertragen, während HBV, HCV und HDV durch Kontakt mit dem Blut und den Körperflüssigkeiten einer infizierten Person übertragen werden [19]. Eine Virushepatitis-Erkrankung verläuft oft ohne Symptome. Allerdings kann sich eine chronische Hepatitis zu Gelbsucht, Anorexie, Fibrose und schließlich zu Leberzirrhose und Leberkrebs entwickeln. Menschen mit Hepatitis verspüren zunächst grippeähnliche Symptome, ähnlich wie bei vielen anderen akuten Virusinfektionen. Weitere mögliche Symptome sind Müdigkeit, Fieber, Gelenk- und Muskelschmerzen, Gelbsucht (Gelbfärbung der Augen und der Haut) sowie Bauchschmerzen. In den meisten Fällen ist die Immunantwort des Wirts in der Lage, das Virus zu eliminieren. Diese Rate schwankt jedoch zwischen 100 % Clearance bei HAV und nur 20–30 % Clearance bei akuten HCV-Fällen. Wenn HBV- und HCV-Infektionen bis zu 6 Monate andauern, können sie als chronische Hepatitis B bzw. C definiert werden. Jede Virushepatitis wird durch eine Anamnese, eine körperliche Untersuchung, Leberfunktionstests, Antikörperserologietests und einen auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) basierenden Test auf virale Nukleinsäure (RNA oder DNA) diagnostiziert. Der Mensch ist der einzige bekannte Wirt für Hepatitisviren, mit Ausnahme von HEV, das möglicherweise ein Reservoir in Haustieren hat [20].

HAV wurde erstmals 1973 identifiziert. Es handelt sich um ein unbehülltes, ikosaedrisches, einzelsträngiges RNA-Virus, das zur Familie der Picornaviren gehört. Derzeit kann HAV in drei Genotypen unterteilt werden, darunter I, II und III, mit zwei Subtypen, einschließlich der Subtypen A und B, die Menschen infizieren können. Die Übertragung erfolgt in der Regel fäkal-oral, entweder durch persönlichen Kontakt und durch den Verzehr oder das Trinken kontaminierter Lebensmittel oder Wasser. HAV ist in vielen Ländern endemisch, insbesondere in Ländern mit begrenzten Gesundheitsressourcen [21]. Die Prävalenz einer HAV-Infektion ist in entwickelten Ländern gering. Die Seroprävalenz von Anti-HAV-Antikörpern beträgt in den Vereinigten Staaten etwa 10 % bei Kindern und 37 % bei Erwachsenen. Mehr als 50 % der Fälle in Industrieländern sind das Ergebnis einer Infektion durch Reisen in Endemieländer [22]. HAV kann eine akute Infektion verursachen, die normalerweise selbstlimitierend ist und nicht zu einer chronischen Infektion oder chronischen Lebererkrankung führt. Die Inkubationszeit des HAV beträgt zwischen 15 und 50 Tagen (28 Tage) ab der Exposition. Personen mit chronischen Grunderkrankungen haben ein höheres Risiko, aufgrund einer HAV-Infektion ein akutes Leberversagen zu entwickeln. Die Sterblichkeitsrate liegt für alle Altersgruppen bei 0,3 bis 0,6 % und steigt bei Patienten über 49 Jahren auf 1,8 % [23]. Die Ausbreitung von HAV in der Leber erfolgt über die Pfortader (das Blutgefäß, das Blut aus dem Darm zur Leber transportiert), nachdem das Virus die Schleimhaut der Dünndarmwand passiert hat. Anschließend vermehren sich die Viren in Hepatozyten, bevor sie wieder über die Galle und den Kot ausgeschieden werden [24]. Akute Hepatitis A wird hauptsächlich durch das Vorhandensein eines Immunglobulin-M-Antikörpers gegen HAV (IgM-Anti-HAV) diagnostiziert. Anti-HAV-IgM wird einige Tage vor oder gleichzeitig mit dem Auftreten der Symptome nachweisbar. Der Serum-IgM-Spiegel steigt während einer akuten Infektion an und bleibt durchschnittlich 4 Monate nach Auftreten der Symptome positiv. IgG-Anti-HAV tritt früh im Verlauf der Infektion auf und ist viele Jahre lang nachweisbar, was zu einer lebenslangen Immunität führt. Obwohl Nukleinsäureamplifikationstechniken (NAAT; wie PCR) zum Nachweis von HAV empfindlicher sind als der Immunoassay-Test, werden sie für diesen Zweck selten eingesetzt. Sequenzierung und phylogenetische Analyse werden hauptsächlich zur Verfolgung von Ausbrüchen eingesetzt, und diese Techniken sind besonders nützlich für die Identifizierung von Übertragungswegen [24, 25]. Derzeit verfügbare Impfstoffe gegen HAV sind sicher und hochwirksam und werden in verschiedenen Ländern in routinemäßige Impfprogramme für Kinder einbezogen [26]. Der Standardimpfplan für den inaktivierten Impfstoff gegen HAV besteht aus zwei Dosen, die im Abstand von mindestens 6 Monaten verabreicht werden. Dieser Impfplan hat sich als äußerst schützend erwiesen und wird voraussichtlich viele Jahre anhalten [27].

HBV ist ein Prototyp der Familie Hepadnaviridae. Es handelt sich um umhüllte Viren, die entspannte, zirkuläre, teilweise doppelsträngige DNA enthalten [28]. Obwohl HBV ein DNA-Virus ist, erfolgt die Replikation durch reverse Transkription von prägenomischer RNA (pgRNA) [29]. Derzeit wird HBV in 10 Genotypen eingeteilt, darunter die Genotypen A bis J, basierend auf Unterschieden in der Genomsequenz, mit 35 Subgenotypen. Die Verteilung der Genotypen ist weltweit sehr unterschiedlich [30]. HBV ist eine der häufigsten Ursachen für Lebererkrankungen, einschließlich Leberkrebs, und hoch ansteckend. Die Übertragung erfolgt durch Kontakt mit infiziertem Blut und anderen Körperflüssigkeiten (insbesondere Fruchtwasser, Sperma und Vaginalflüssigkeit) [31, 32]. Es ist 100-mal ansteckender als HIV und auch 10-mal ansteckender als HCV [22]. Die Prävalenz einer HBV-Infektion variiert in verschiedenen Regionen der Welt und reicht von 0,7 % der erwachsenen Bevölkerung in Gebieten mit geringer Endemie wie Nordamerika, Westeuropa und Teilen Südamerikas bis zu 6,2 % in Gebieten mit hoher Endemie wie Afrika , Südostasien und China [30]. Die Gesamtprävalenz chronischer HBV in den USA betrug etwa 3/5 % [33]. Eine HBV-Infektion kann sowohl zu einer akuten (kurzfristigen) als auch zu einer chronischen (langfristigen) Erkrankung führen. Eine akute HBV-Infektion kann asymptomatisch oder symptomatisch verlaufen. Die meisten infizierten Erwachsenen erholen sich, auch wenn ihre Anzeichen und Symptome schwerwiegend sind, aber 5–10 % der infizierten Erwachsenen entwickeln eine chronische Infektion, die möglicherweise zu Leberzirrhose und Leberkrebs führt [34]. HBV hat einen spezifischen Tropismus für Leberzellen, an denen es während der Primärinfektion haftet und fusioniert. HBV wird durch Endozytose in Hepatozyten internalisiert, nachdem es an seinen hochaffinen Rezeptor, das Natriumtaurocholat-Cotransport-Polypeptid (NTCP), gebunden hat. Das Kapsid des Virus wird dann in das Zytoplasma freigesetzt und über das Mikrotubuli-Netzwerk in die Kernpore verlagert. An der Kernpore wird rcDNA im Zellkern freigesetzt, wo sie in kovalent geschlossene zirkuläre DNA (cccDNA) umgewandelt wird. In diesem Schritt wird cccDNA chromatinisiert und dient als Transkriptionsvorlage für alle prägenomischen HBV-RNAs. Im Zytoplasma wird pgRNA eingekapselt und in rcDNA retrotranskribiert. Die Kapside werden entweder umhüllt und als neue Virionen aus der Zelle ausgeschieden oder zurück zum Zellkern transportiert, um den cccDNA-Pool zu verstärken [35]. Von HBV-DNA kodierte verschiedene Proteine ​​spielen eine wesentliche Rolle bei der Viruspersistenz und Leberpathogenese, darunter zwei Kernproteine, ein partikuläres Kernantigen (HBcAg) und ein sekretiertes Antigen (HBeAg), Oberflächenantigen (HBsAg), HBx und Polymerase und alle die bei der Diagnose und Überwachung eine Rolle spielen [24, 36]. Nach der Infektion können HBV-DNA und HBsAg innerhalb von 1 bis 2 Wochen im Serum einer infizierten Person nachweisbar sein. Sechs bis acht Wochen später werden IgM-Anti-HBc und HBeAg nachweisbar. Bei akuten HBV-Infektionen verschwinden HBsAg und HBeAg innerhalb von 4–6 Monaten. Auf das Verschwinden von HBsAg folgt das Auftreten von Antikörpern gegen HBsAg (Anti-HBs). Der Zeitraum zwischen dem Verschwinden von HBsAg aus dem Serum und dem Auftreten von Anti-HBs darin wird als Fensterphase bezeichnet und kann bis zu 6 Monate dauern [22]. Daher wird der erste Schritt der HBV-Diagnose mit einem serologischen Test zum Nachweis von HBsAg und anderen HBV-Antigenen und -Antikörpern durchgeführt. Weitere molekulare Tests zum quantitativen und qualitativen Nachweis dienen der Verifizierung des ersten Diagnoseschritts (Tabelle 1) [37]. Unter Reaktivierung von HBV versteht man einen plötzlichen Anstieg der HBV-Replikation bei einem Patienten mit chronischer oder früherer HBV-Infektion. Obwohl eine HBV-Reaktivierung (HBVr) spontan auftreten kann, wird sie häufiger durch die immunsuppressive Arzneimitteltherapie (ISDT) bei Krebs, immunologischen Erkrankungen oder Transplantationen induziert [38]. Die Impfung ist eine äußerst wirksame Strategie zur Vorbeugung von HBV-Infektionen. Eine Drei-Dosen-Impfserie mit Hepatitis-B-Impfstoffen (rekombinant), bestehend aus HBsAg, führt bei > 90 % der gesunden Personen zu einem Schutzniveau an Anti-HBs-Titern [39].

HCV, ein Mitglied der Flaviviridae-Familie, verfügt über ein einzelsträngiges RNA-Genom mit positivem Sinn, das drei strukturelle und sieben nichtstrukturelle Proteine ​​codiert. Die hohe Mutationsrate von HCV führt zu einer ausgeprägten genomischen Heterogenität. HCV wird in sieben bestätigte Genotypen und mindestens 67 bestätigte Subtypen eingeteilt. Mittlerweile sind die Genotypen 1–3 weltweit verbreitet, während die Genotypen 4–6 in einem bestimmten Gebiet konzentriert sind. HCV-Genotyp 4 und Subtyp 5a sind im Nahen Osten bzw. im nördlichen Teil Südafrikas endemisch. Die HCV-Genotypen 6 und 7 werden hauptsächlich in Südostasien bzw. der Demokratischen Republik Kongo beobachtet [24, 40]. Die Hauptformen der HCV-Übertragung erfolgen über das Blut, beispielsweise durch intravenösen und intranasalen Drogenkonsum, Kontamination von Medikamenteninjektionen und durch sexuellen Kontakt [41]. Die weltweite Prävalenz von HCV wird in den am stärksten betroffenen Gebieten auf 1,5–2,3 % und in anderen Gebieten auf 0,5–1,0 % geschätzt [42]. Die Prävalenz von HCV bei injizierenden Drogenkonsumenten liegt zwischen 50 und 90 %, was die größte Gruppe unter den Infizierten darstellt [43]. HCV kann akute Infektionen mit hoher Tendenz zu chronischen Erkrankungen verursachen. Chronisches HCV kann zu schweren Lebererkrankungen einschließlich Zirrhose und dem Risiko eines HCC führen [44]. Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ I (SCARB1), Okkludierend (OCLN), Claudin-I (CLDN1) und Differenzierungscluster 81 (CD81) sind die wichtigsten Wirtsfaktoren, die die Anlagerung und Aufnahme von HCV in Hepatozyten erleichtern. Darüber hinaus interagiert CD81 mit dem Viruspartikel über das Glykoprotein E2 der Virushülle oder andere Moleküle und erleichtert so den Eintritt des Viruspartikels in die Hepatozyten [45]. Die virologische Diagnose von HCV wird durch zwei Kategorien von Labortests erstellt, darunter indirekte Tests, bei denen serologische Tests durchgeführt werden, um einen spezifischen HCV-Antikörper (Anti-HCV) im infizierten Patienten nachzuweisen, und direkte Tests, bei denen der Nachweis quantifiziert wird oder eine Charakterisierung der Komponenten von HCV-Viruspartikeln wie HCV-RNA und Core-Antigen durchgeführt werden. Die Sensitivität und Spezifität von Enzymimmunoassays (EIAs) der dritten Generation zum Nachweis von Antikörpern gegen verschiedene Antigene des HCV-Viruspartikels beträgt 2 bis 6 Monate nach der Virusexposition 99 %. Eine der direkten Testmethoden ist die Verwendung der Echtzeit-PCR zum quantitativen oder qualitativen Nachweis von HCV-RNA, mit der HCV-Partikel bei Patienten mit mindestens 10–15 IU/ml nachgewiesen werden können (Tabelle 2) [46].

HDV, ein Mitglied der Gattung Deltavirus, ist ein umhülltes, kreisförmiges, einzelsträngiges Negativ-RNA-Virus, das für zwei Arten von Proteinen kodiert; das kleine Protein (S-HDAg) und das große Protein (L-HDAg), die jeweils 24 kDa und 27 kDa groß sind. S-HDAg ist für die virale RNA-Replikation erforderlich, während L-HDAg für die virale Assemblierung essentiell ist [47]. HDV gilt als Satellitenvirus, da es die Unterstützung von HBV-Oberflächenproteinen (HBsAg) benötigt, um reife Virionpartikel zu erzeugen. Infolgedessen können sich zwei unterschiedliche Infektionsmuster für HDV etablieren; entweder HBV/HDV-Koinfektion oder HDV-Superinfektion. Eine HBV/HDV-Koinfektion tritt auf, wenn eine Person gleichzeitig sowohl mit HBV als auch mit HDV infiziert wird, wohingegen eine HDV-Superinfektion auftritt, wenn eine Person, die bereits chronisch mit HBV infiziert ist, HDV erwirbt. Die Entwicklung einer chronischen HDV-Superinfektion kann die durch HBV verursachte Leberschädigung verschlimmern, und es wurde gezeigt, dass sowohl eine Koinfektion als auch eine Superinfektion schwerwiegendere Folgen haben als eine HBV-Infektion allein, einschließlich fulminanter Hepatitis, HCC und chronischer Hepatitis [48]. Derzeit wurden drei HDV-Genotypen identifiziert (Genotyp I–III), unter denen Genotyp I vorherrschend ist [22]. Wie HBV und HCV wird HDV hauptsächlich sexuell sowie durch Kontakt mit infiziertem Blut und Blutprodukten übertragen [28]. Schätzungen zufolge sind weltweit etwa 5–10 % der Patienten mit chronischer Hepatitis B (CHB) mit HDV koinfiziert, wobei die Prävalenz bei injizierenden Drogenpopulationen höher ist. Zu den Gebieten mit einer hohen Prävalenz von HDV-Infektionen gehören das Mittelmeerbecken, Südamerika, die Mongolei und der Sudan. In Nordamerika und Nordeuropa ist die Prävalenz gering und beschränkt sich meist auf injizierende Drogenkonsumenten [22, 49]. Der erste Schritt bei der Diagnose einer HDV-Infektion besteht darin, HBsAg-positive Personen auf die HDV-spezifischen Gesamtantikörper (kombiniertes IgG und IgM) im Serum zu testen. Bei Anti-HDV-Antikörper-positiven Patienten besteht der nächste Schritt darin, das Serum auf HDV-RNA zu testen, um festzustellen, ob der Antikörper eine laufende aktive HDV-Infektion darstellt (HDV-RNA-positiv) oder nur eine serologische Narbe darstellt (HDV-RNA-negativ) [ 50].

HEV wurde erstmals 1983 entdeckt, als Wissenschaftler nach der Ursache für den Ausbruch der enteral übertragenen Non-A-Non-B-Hepatitis (NANB) suchten [51]. HEV gehört zur Gattung Hepevirus der Familie Hepeviridae. [52, 53]. Basierend auf der vollständigen Genomsequenzierung von menschlichen und tierischen Stämmen wurden drei Gruppen von Hepeviridae-Säugetieren erkannt. Die erste Kategorie besteht aus Viren, die Menschen, Schweine, Hirsche und Kaninchen befallen. Die 24 Subgenotypen der vier humanen HEV-Genotypen (Genotypen 1–4), die bei infizierten Patienten identifiziert wurden, sind in dieser Gruppe enthalten [53]. HEV wird am häufigsten durch Kontamination von Wasser und Nahrungsmitteln übertragen, seltener über den zoonotischen Weg oder durch Bluttransfusionen [52]. Die HEV-Genotypen 1–4 zeigen eine ausgewählte geografische Verteilung. Die Genotypen 1 und 2 sind die Hauptursachen für akute HEV-Infektionen in Endemiegebieten in Südasien und Afrika südlich der Sahara [54]. Genotyp 3 ist der häufigste Genotyp, der in Europa und Amerika mit einer HEV-Infektion assoziiert ist [55]. Der HEV-Genotyp 4 wurde zunächst nur in Asien identifiziert, weitere Berichte haben diesen Genotyp jedoch auch bei Schweinen und Menschen in Europa identifiziert [52]. Die HEV-Genotypen 1 und 2 sind obligate menschliche Krankheitserreger und werden hauptsächlich durch kontaminiertes Trinkwasser in Gebieten mit schlechter Hygiene übertragen, während die Genotypen 3 und 4 zoonotisch sind und hauptsächlich durch den Verzehr von rohem oder nicht gegartem Fleisch oder Leberprodukten ihres Hauptwirts (d. h , Schweine, Wildschweine und Hirsche) [56]. Eine HEV-Infektion ist im Allgemeinen selbstlimitierend und verursacht eine akute Hepatitis. Eine Infektion mit HEV hat eine Inkubationszeit von 15 bis 60 Tagen. Typisches akutes HEV kann zu einem Anstieg der Aminotransferasen auf mehr als das Zehnfache des Normalwerts führen. Die wichtigsten beschriebenen klinischen Symptome sind Anorexie, Übelkeit, Unwohlsein und Bauchschmerzen sowie Arthralgien, Durchfall, Juckreiz und Ausschlag. Innerhalb von 1 bis 6 Wochen nach den Infektionen normalisieren sich die Aminotransferasen wieder. Die Sterblichkeitsrate beträgt bei Erwachsenen etwa 0,5 bis 3 %. HEV kann auch ein fulminantes Leberversagen (FHF) verursachen, bei dem sich innerhalb von Tagen oder Wochen nach Auftreten der Symptome eine Enzephalopathie entwickelt. FHF scheint häufiger bei schwangeren Frauen aufzutreten, daher weist HEV bei schwangeren Frauen eine höhere Sterblichkeitsrate auf [22]. Für die HEV-Diagnose für epidemiologische und diagnostische Zwecke wurden sowohl serologische als auch nukleinsäurebasierte Tests entwickelt. Der serologische Test auf eine HEV-Infektion hängt normalerweise vom Nachweis von Anti-HEV-IgG und Anti-HEV-IgM ab. Anti-HEV-IgM-Antikörper sind normalerweise in der akuten Phase der Erkrankung nachweisbar und ihre Präsenz im Serum hält etwa 4 bis 5 Monate an, was auf eine kürzliche Exposition hindeutet, während Anti-HEV-IgG-Antikörper länger als 10 Jahre persistieren können, was auf eine frühere Exposition hindeutet. Daher basiert die Diagnose einer akuten HEV-Infektion auf dem Vorhandensein von Anti-HEV-IgM, während der Anti-HEV-IgG-Diagnosetest eine gute Option für epidemiologische Untersuchungen darstellt [57]. Allerdings ist der Nachweis und die Quantifizierung von HEV-RNA mittels PCR ein Goldstandardansatz für die Diagnose akuter und chronischer HEV-Infektionen [58]. Derzeit sind keine spezifischen Impfstoffe außer dem in China zugelassenen oder therapeutische Optionen für HEV verfügbar [22].

Als Infektionserreger potenziell aller Arten lebender Zellen sind Viren die am häufigsten vorkommenden biologischen Einheiten in der Umwelt, die eine Epidemie auslösen können, die das Leben und die Gesundheit von Menschen und Tieren bedroht und erhebliche wirtschaftliche Verluste verursacht. Das Auftreten eines schweren Ausbruchs führt häufig zu irreversiblen Verlusten oder Schäden, daher ist eine frühzeitige und schnelle Diagnose der Virusinfektion besonders wichtig [59]. Die traditionellen Techniken zur Labordiagnose von Virusinfektionen lassen sich normalerweise in drei Kategorien einteilen: (1) direkter Nachweis von Virionen in Patientenmaterial, viralen Antigenen oder viralen Nukleinsäuren, (2) Virusisolierung in kultivierten Zellen, gefolgt von der Identifizierung des Isolats (Indirekte Untersuchung) und (3) serologische Diagnose, die auf dem Nachweis und der Messung von Antikörpern im Serum des Patienten basiert [60]. Das beste Virusdiagnosetool sollte die folgenden Anforderungskriterien erfüllen: Geschwindigkeit, Einfachheit, Sensitivität, Spezifität und Kosten. Nukleinsäureamplifikationstest (NAAT), einschließlich PCR, Echtzeit-PCR, RT-PCR, Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation (NASBA) und schleifenvermittelte isotherme Amplifikation (LAMP) sowie auf Antikörper-Antigen-Komplex-Detektion basierende Methoden wie z Insbesondere die Festphasen-Enzymimmunoassays (EIAs) und die ELISA-Technologie (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) haben die diagnostische Virologie revolutioniert und werden heute häufig zum Nachweis verschiedener Viren eingesetzt (61, 62). Aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität gelten NAATs derzeit als „Goldstandard“-Methode zur Diagnose viraler Infektionen. Allerdings sind PCR-basierte Virusdiagnosetechniken durch die hohen Kosten für Reagenzien und Instrumente sowie den anspruchsvollen technischen Betrieb begrenzt. Die Analysemethode der neuen Generation, die auf der in CRISPR-Cas-Systemen beobachteten unspezifischen DNA- und RNA-Spaltung basiert, bietet aufgrund ihrer hohen Spezifität, Vielseitigkeit und ihres schnellen Erkennungszyklus vielversprechende Fortschritte in der CRISPR-basierten Diagnostik neu auftretender Infektionen [62, 63].

Die entscheidende Entdeckung, dass prokaryotische Zellen wie Bakterien und Archaeen über eine vererbbare adaptive Immunität gegen fremde genetische Elemente verfügen, die über CRISPR und CRISPR-assoziierte (Cas) Proteine ​​vermittelt wird, hat zu transformativen Fortschritten in der Molekularbiologie geführt [64]. Prokaryontische Zellen speichern diese genetischen Elemente von Infektionserregern wie Bakteriophagen, Plasmiden oder Transposons in einem genomischen Locus, den sogenannten CRISPR-Arrays, und ermöglichen es der Zelle, sich an Infektionen zu erinnern, sie zu erkennen und zu beseitigen. Cas-Proteine ​​erleichtern die adaptive Immunität durch den mehrstufigen Prozess, der Anpassung, CRISPR-RNA (crRNA)-Biogenese und Interferenz umfasst. Während der Anpassung, der ersten Stufe der CRISPR-Immunität, werden fremde genetische Elemente erkannt, verarbeitet und für die Integration in das CRISPR-Array ausgewählt, wodurch bei wiederkehrenden Infektionen ein Erinnerungselement bereitgestellt wird. Während der Expressionsphase, auch crRNA-Biogenese genannt, wird das CRISPR-Array in einen langen Vorläufer (Prä-crRNA) transkribiert und in die reife Form als crRNA verarbeitet. Im letzten Stadium leiten die reifen crRNAs Cas-Proteine ​​an, komplementäre Sequenzen fremder DNA zu spalten (Interferenz) und diese Elemente zu eliminieren. Durch die Aufdeckung der strukturellen und funktionellen Komponenten dieser verschiedenen Systeme entstehen neue Werkzeuge, auch solche, die für die molekulare Diagnostik anwendbar sind [65].

Seit der ersten Entdeckung des CRISPR-Cas-Systems haben sich seine verschiedenen Varianten rasch ausgeweitet. Derzeit werden CRISPR-Cas-Systeme basierend auf evolutionären Beziehungen in zwei Klassen, sechs Typen und mehrere Untertypen unterteilt. Abhängig von der Art der Effektor-Ribonukleoprotein-Komplexe wurden zwei Hauptklassen von CRISPR-Cas-Systemen definiert; Klasse 1 (einschließlich Typ I, III und IV) und Klasse 2 (einschließlich Typ II, V und VI). Systeme der Klasse 1 zeichnen sich durch einen Komplex aus mehreren Effektorproteinen aus, und Systeme der Klasse 2 umfassen ein einzelnes crRNA-bindendes Protein [11]. Die meisten der identifizierten CRISPR-Cas-Systeme (ca. 90 %) gehören zu Systemen der Klasse 1 [16]. Unter den verschiedenen CRISPR-Systemen werden vor allem Klasse-2-Systeme für die Diagnostik eingesetzt, da diese Systeme einfacher zu rekonstruieren sind. Dazu gehören Enzyme mit Nebenaktivität, die als Rückgrat vieler CRISPR-basierter Diagnosetests dienen. Cas9, Cas12 und Cas13 haben einen großen Einfluss auf die CRISPR-Cas-Klassifizierung für Typ II, Typ V und Typ VI als jeweils einzigartige Signatur-Effektornukleasen. Die neueste Klassifikation der CRISPR-Cas-Systeme ordnet die größte Anzahl an Untergruppen dem Typ-V-System mit 17 abgeleiteten Untergruppen zu [11]. Klasse-1-Systeme (wie die Typ-III-Effektornuklease Csm6 oder Cas10) wurden ebenfalls für die Diagnostik entwickelt, entweder in Kombination mit Komponenten des Klasse-2-Systems oder mit dem nativen Typ-III-Komplex) [66]. Eine RuvC-ähnliche Nukleasedomäne im Cas12-System katalysiert die Spaltung eines dsDNA-Ziels durch Typ-V-Systeme [67]. Dieses Merkmal hat zur Verwendung von Cas12a, auch bekannt als Cpf1, in Tests zur Diagnose viraler Krankheitserreger geführt [68, 69]. Das CRISPR-Cas-Typ-VI-System verfügt über fünf Subtypvarianten. Cas13a im Subtyp VI-A ist als RNA-gesteuerte Rnase bekannt [16]. Cas13a ist in der Lage, an crRNA zu binden und so einen Komplex zu bilden, der schließlich ssRNA spaltet [12]. Die Fähigkeit von Cas13a, ssRNA zu spalten, hat zur Entwicklung moderner Plattformen für den schnellen und empfindlichen Nachweis von Infektionskrankheiten geführt. Jede der Cas12a- und Cas13a-basierten Plattformen zur Diagnose viraler Infektionen wird im nächsten Abschnitt besprochen (Abb. 1) [70, 71].

Klassifizierung der CRISPR-Cas-Systemklassen anhand ihrer Effektorproteine

Aufgrund der Programmierbarkeit von CRISPR-Cas-Systemen wurden sie in vielen verschiedenen Bereichen der Biologie und Medizin eingesetzt und haben diese Bereiche tatsächlich revolutioniert. Immer mehr Studien haben gezeigt, dass die CRISPR/Cas-Technologie in Biosensoren und Bioassays für die molekulare Diagnostik integriert werden kann. CRISPR-basierte Diagnostik hat als hochspezifische und empfindliche Sensoren mit einfach programmierbaren und geräteunabhängigen Funktionen große Aufmerksamkeit erregt. Diese Technik wurde zur Erkennung nukleinsäurebasierter Biomarker infektiöser und nichtinfektiöser Krankheiten sowie zur Erkennung von Mutationen und Deletionen, die auf genetische Krankheiten hinweisen, eingesetzt. Mit weiteren Forschungen ist es vielversprechend, andere Biomarker wie kleine Moleküle und Proteine ​​nachzuweisen [66, 72]. In diesem Abschnitt beschreiben wir kurz die Anwendung von CRISPR/Cas-Systemen im Bereich der Diagnostik.

Das Hauptziel von CRISPR-basierten Diagnoseansätzen ist die Identifizierung spezifischer Krankheitserreger, wie zum Beispiel DNA- oder RNA-Viren, Bakterien und Parasiten. Zu den RNA-Viren, die mit dem CRISPR-basierten Ansatz erkannt wurden, gehören Parvovirus B19, Zika-Virus (ZIKV), Dengue-Virus (DENV), Japanisches Enzephalitis-Virus, Ebola-Virus (EBOV) und Corona-Virus. Neben RNA-Viren wurden auch DNA-Viren wie das Cytomegalievirus (CMV), das Epstein-Barr-Virus, das BK-Virus (BKV) und das humane Papillomavirus (HPV) mit der CRISPR-basierten Diagnostik erkannt [73]. Das CRISPR/Cas-System wurde auch zum Nachweis verschiedener pathogener Bakterien wie Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa und Salmonella enteritidis eingesetzt [74]. Darüber hinaus wurde die Technik von CRISPR/Cas erfolgreich zum ultraempfindlichen Nachweis des für Malaria verantwortlichen Plasmodium-Parasiten eingesetzt [75].

CRISPR-Cas-basierte Diagnosetechnologien wurden auch zum Nachweis von genetischem Material eingesetzt, das für nichtinfektiöse Krankheiten relevant ist. Beispielsweise wurde dieses System verwendet, um abnormale Mengen an menschlicher CXCL9-mRNA zu erkennen, einem Indikator für eine akute Abstoßung von zellulären Nierentransplantaten, um eine Transplantat-gegen-Wirt-Krankheit bei Nierentransplantationen zu erkennen (76). Neben mRNAs wurde ein CRISPR-basiertes Diagnosesystem auch zum Nachweis spezifischer miRNAs wie miR-19b im Serum von Medulloblastompatienten (77) und miR-17, das aus Brustkrebszelllinien isoliert wurde (78), verwendet.

Eine wesentliche Stärke der CRISPR-basierten Diagnostik ist die Einzelnukleotidspezifität von Cas-Enzymen, die die Unterscheidung von Punktmutationen (SNPs) und kleinen Deletionen ermöglicht. Die Einzelnukleotidspezifität des CRISPR-basierten Nachweises hat es diesem System ermöglicht, Marker für antimikrobielle Resistenz, Deletionen und Mutationen im epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Gen (EGFR) und BRAF (79) zu erkennen, Mutationen, die Duchenne-Muskeldystrophie verursachen (80). ] und SNPs im E3-Ubiquitin-Ligase-Gen, die die Augenfarbe verleihen. Das Spezifitätspotenzial des CRISPR-Cas-Systems wurde auch für den Nachweis von miRNAs genutzt, deren Diagnose aufgrund ihrer geringen Größe und der Tatsache, dass sie sich nur durch eine einzige Base unterscheiden können, schwierig zu diagnostizieren ist (66).

Eine genaue, sensible und schnelle Diagnose von Virusinfektionen ist der entscheidende erste Schritt zu einer genauen und zeitnahen Behandlung von Virusinfektionen. Die CRISPR-Cas-basierte Diagnose von Krankheitserregern hat in den letzten Jahren enorm an Popularität gewonnen, vor allem aufgrund der hohen Spezifität, Sensitivität und schnellen Diagnose dieses Systems [81]. Zahlreiche Variationen und Weiterentwicklungen wurden in die CRISPR-basierte Plattform eingeführt, die auf der Nebenaktivität von CRISPR-Cas-Typ-V- und Typ-VI-Proteinen basiert, aber das allgemeine Konzept bleibt unverändert. Im Folgenden stellen wir die verschiedenen Plattformen vor, die auf den CRISPR-assoziierten Nukleasen Cas9, Cas12 oder Cas13 basieren und zur Diagnose verschiedener Virusinfektionen eingesetzt werden.

Im Jahr 2016 stellten Pardee et al. führte die erste CRISPR/Cas-basierte Diagnosemethode ein, die dsDNA erkennen kann. Sie entwickelten eine schnelle und kostengünstige Diagnosemethode zum Nachweis des Zika-Virus mithilfe von CRISPR Typ II, die sogenannte Nukleinsäuresequenz-basierte Amplifikation-CRISPR-Spaltung (NASBACC). Das NASBACC-System besteht aus drei Teilen: Nukleinsäuresequenz-basierter Amplifikation für die isotherme Voramplifikation von Zielen, Protospacer-Advanced-Motiv (PAM)-abhängiger Ziel-DNA-Erkennung durch Cas9 und einem Haltedetektor für die Auslesung. Kurz gesagt, ein ausgelöster Zehenschalter bindet über reverse Transkription an ein NASBA-amplifiziertes RNA-Fragment. Wenn die PAM-Sequenz im RNA-Fragment vorhanden ist, führt die Cas9-vermittelte Spaltung zu einer kurzen RNA ohne Triggersequenz. In Abwesenheit der PAM-Sequenz aktiviert der Auslöser, der die RNA voller Länge enthält, den Halteschalter, was durch einen Farbwechsel angezeigt wird [82]. Doch im selben Jahr, als die kollaterale Spaltungsaktivität von Cas13a entdeckt wurde, wurde dieses Gebiet revolutioniert. Die Kollateralaktivität erfordert die Spaltung von nicht zielgerichteter einzelsträngiger RNA (ssRNA; Cas13) und einzelsträngiger DNA (ssDNA; Cas12) in einer Lösung, was die Erkennung von Nukleinsäuren durch Signalverstärkung und die Ermöglichung mehrerer Auslesungen durch die Zugabe funktionalisierter Substanzen ermöglicht Reporter-Nukleinsäuren. In jüngsten Studien wurden verschiedene CRISPR-basierte Methoden entwickelt, wie z. B. DNA Endonuclease-Targeted CRISPR Trans Reporter (DETECTR) und Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing (SHERLOCK)-Techniken, die Typ-V-CRISPR-CAS12a- und Typ-VI-Cas13a-Enzyme verwenden , jeweils. Das SHERLOCK-System verwendet die Cas13-Endonuklease, um RNA-Stränge abzubauen, und das DETECTR-System verwendet das Cas12a-Protein, um dasselbe an der DNA zu bewirken [16, 68].

Die erste anwendbare Plattform basierend auf dem CRISPR-Cas Typ VI (Cas13)-System, SHERLOCK, wurde 2017 vom Zhang Lab auf der Grundlage der Aktivität der Cas13-Nuklease aus Leptotrichia wadei entwickelt [16]. Das SHERLOCK CRISPR-Cas-System bezieht sich auf den Nachweis neuartiger Nukleinsäuren unter Verwendung von Cas13- oder Cas12-Nukleasen gepaart mit einem isothermen Voramplifikationsschritt, um die Menge an DNA oder RNA zu erhöhen, die bei der Erkennung einer spezifischen Zielsequenz ein hohes Maß an kollateraler RNase-Aktivität aufweist. Das SHERLOCK-System besteht aus drei grundlegenden Schritten: (1) Der erste Schritt ist die isotherme Voramplifikation, die mithilfe spezifischer Primer mehrere Kopien einer RNA- oder DNA-Matrize erzeugt. (2) Als nächstes wird der Vorwärtsprimer, der einen T7-Promotor enthält, während der RPA-Reaktion in die Amplifikate integriert. Der T7-Promotor ermöglicht die T7-RNA-Transkription von dsDNA, um diese in ssRNA-Amplikons umzuwandeln, um Ziele für Cas13a aus dem Leptotrichia wadeii (LwaCas13-crRNA)-Komplex bereitzustellen. Die Erkennung und Basenpaarung zwischen crRNA und der Zielsequenz aktiviert die Kollateralaktivität von LwaCas13a, was zu einem sequenzunspezifischen Abbau benachbarter gelöschter RNA-Reporter führt. (3) Im letzten Schritt wird der fluoreszenzbasierte Nukleinsäurenachweis mit LwaCas13a durch die Einbindung einer Fluoreszenz erreicht Sonde, die ein erkennbares Signal aussendet. ssRNA-Reportermoleküle bestehen aus einem Fluorophor und einem Quencher, die durch ein kurzes RNA-Oligomer miteinander verbunden sind, das nach der Trennung die Trennung des Fluorophors vom Quencher ermöglicht und dadurch ein Fluoreszenzsignal aussendet, das bestimmt das Vorhandensein der RNA-Viren (Abb. 2). Das SHERLOCK-System ist hochempfindlich und kann ein Attomol (aM oder 10–18 M) des Ziels erkennen [66, 83].

SHERLOCK-Methoden zur Nukleinsäuredetektion basierend auf der CRISPR-Technologie

Kürzlich wurde eine zweite Version des SHERLOCK-Systems namens SHERLOCKv2 entwickelt, deren Fertigstellung etwa 2 Stunden dauert und die Nachweisempfindlichkeit ebenfalls auf zwei Attomol erhöht [79]. Bei dieser Plattform wird der Probe Cas-Protein zusammen mit der crRNA (die für die spezifische Bindung an die Zielsequenz entwickelt wurde) und den ssDNA-Sonden (als Reporter) zugesetzt. Die Sonden sind an einem Ende mit einem Fluorophor und am anderen Ende mit einem Quencher verbunden. Wenn sich in der Probe eine Zielsequenz befindet, bindet die crRNA an diese Sequenz und die Kollateralaktivität von Cas13a wird aktiviert und spaltet die Sonden. Dadurch werden Fluorophore freigesetzt und ein stabiles und starkes Fluoreszenzsignal wird von einem Fluorimeter erfasst [84]. Die Überlegenheit von SHERLOCKv2 gegenüber SHERLOCK ist insofern wichtig, als die gesamte SHERLOCKv2-Reaktion in einem Schritt durchgeführt wird, indem die Probe direkt auf den Teststreifen gegeben wird. Darüber hinaus ist keine Reinigung und Trennung der Nukleinsäuren an den Proben erforderlich [85]. Es wurden verschiedene Plattformen entwickelt, die auf dem Cas13-Protein basieren. Myhrvold et al. entwickelte HUDSON (Erhitzen nicht extrahierter diagnostischer Proben zur Auslöschung von Nukleasen) und kombinierte es mit SHERLOCK. Durch diese Kombination konnten sie Dengue- und Zika-Viren direkt in Körperflüssigkeiten von Patienten in sehr geringen Konzentrationen (1 Kopie pro Mikroliter) nachweisen. Der Vorteil dieser Plattform besteht darin, dass keine Vorbehandlung der Proben erforderlich ist [86].

Cas12a ist ein weiteres Cas-Enzym mit Nebenaktivität, das DNA-Moleküle erkennt. Eine der ersten Cas12a-basierten Erkennungsplattformen, die 2018 von Doudna et al. entwickelt wurde. war DETECTR [86]. In diesem System wird Cas12a-Protein aus dem Lachnospiraceae-Bakterium (LbCas12a) mit unspezifischer Kollateralaktivität durch eine komplementäre crRNA zu dsDNA-Zielen geleitet, wodurch die Kollateralspaltung kurzer ssDNA-Reporter ausgelöst wird, die ein Fluorophor und einen Quencher tragen. Ähnlich wie bei SHERLOCK führen Zielerkennung und Reporterspaltung zur Trennung des Fluorophors vom Quencher, der ein Fluoreszenzsignal aussendet (Abb. 3) [87]. Cas12a weist eine relativ schwache Kollateralaktivität auf. Daher weisen die Cas12-basierten Diagnosemethoden eine geringe Empfindlichkeit für den Nachweis von Nukleinsäuren auf. Mit der Inkorruption der isothermen Voramplifikation durch RPA erreichte DETECTR eine attomolare Empfindlichkeit für den Nachweis von DNA, was es ihnen ermöglicht, niedrige Zielkonzentrationen (2 aM-Konzentrationen) nachzuweisen [88]. In anderen Cas12-basierten Techniken haben Li et al. nutzte die Begleitaktivität dieses Enzyms und entwickelte eine Detektionsplattform namens HOLMES (ein einstündiges, kostengünstiges, hocheffizientes Mehrzwecksystem) für den schnellen Nachweis von DNA- und RNA-Zielen. Die Basis von HOLMES ähnelt SHERLOCK darin, dass bei Vorhandensein von Ziel-DNA in der Probe die crRNA (im Komplex mit Cas12a) daran bindet, ein ternärer Komplex (CAS12a-crRNA-Ziel-DNA) gebildet wird und die Kollateralaktivität von Das Cas-Enzym wird aktiviert und die Sonden werden abgebaut [87]. Dies sind die am häufigsten verwendeten CRISPR-basierten Erkennungsplattformen zur Identifizierung von Krankheitserregern. Allerdings gibt es andere Plattformen, wie etwa Cas9 – das Finden von Sequenzen mit geringer Häufigkeit durch Hybridisierung (FLASH) und Cas14-DETECTOR, deren Erklärung eine weitere Übersichtsarbeit erfordert [89, 90].

DETECTR-Methoden zur Nukleinsäuredetektion basierend auf der CRISPR-Technologie

Bisher wurden viele DNA- und RNA-Viren mit diesen Methoden diagnostiziert. Das CRISPR-Cas-basierte SHERLOCK-System ermöglicht den Nachweis des Zika-Virus, des Ebola-Virus und des Dengue-Virus mit einer Empfindlichkeit von etwa 1 Kopie pro Mikroliter Probe. Es ermöglichte auch den Nachweis des West-Nil-Virus (WNV), des Gelbfiebervirus (YFV) und des schweren akuten respiratorischen Syndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2). In ähnlicher Weise wurde die DETECTR-Technologie auch zum Nachweis von SARS-CoV-2 eingesetzt. Darüber hinaus können Stämme des humanen Papillomavirus (HPV) (HPV-16 und HPV-18) mit der DETECTR-Technologie diagnostiziert werden. Im nächsten Abschnitt wird die mögliche Anwendung verschiedener CRISPR-Cas-Systeme bei der Diagnose von Virushepatitis diskutiert [91].

Um das Ziel der Weltgesundheitsorganisation, die Virushepatitis bis 2030 zu eliminieren, zu erreichen, ist eine genaue Diagnose der Krankheit erforderlich. Wie bereits erwähnt, sollte der ideale diagnostische Assay eine genaue und empfindliche Identifizierung der Viren ermöglichen, gleichzeitig erschwinglich und tragbar sein und verschiedene Varianten unterscheiden können. Die Entwicklung neuer Instrumente, die den Anforderungen des WHO-Standarddiagnosetests entsprechen, kann die epidemiologische Überwachung und die medizinischen Gesundheitssysteme für Virushepatitis weltweit völlig neu gestalten [85]. In dieser Hinsicht kann das neue CRISPR/Cas-System eine Chance als vielversprechendes Präzisionsdiagnoseinstrument bieten, insbesondere für HBV-DNA und HCV-RNA, die die wichtigsten Indikatoren für Virushepatitis sind, indem es auf virale DNA oder RNA abzielt. In diesem Abschnitt besprechen wir die Studien, die auf dem Gebiet der Erkennung von Hepatitisviren unter Verwendung verschiedener CRISPR-Cas-Plattformen durchgeführt wurden.

Chen X et al. entwickelte eine CRISPR-Cas-basierte Erkennungsplattform, bekannt als „CRISPRHBV“, für die hochempfindliche und frühe Erkennung von zwei wichtigen HBV-Genotypen (HBV-B und HBV-C) in klinischen Anwendungen. CRISPR-HBV besteht aus drei Schritten, darunter Multiple Crossover Displacement Amplification (MCDA) für eine schnelle Voramplifikation, Cas12b-basierte Detektion zur Dekodierung von Zielen und Ergebnisauslesung mit Echtzeit-Fluoreszenz- und Lateral-Flow-Biosensoren. Dieses System ist in der Lage, 10 Kopien genomischer DNA pro Test nachzuweisen, weist eine Spezifität von 100 % auf und weist zudem keine Kreuzreaktivität mit anderen HBV-Genotypen und Krankheitserregern auf. Der gesamte Assay-Prozess, der die Extraktion der DNA-Matrize, die MCDA-Voramplifikationsreaktion, den CRISPR-Cas12b-basierten Nachweis und das Auslesen der Ergebnisse umfasst, kann in 60 Minuten abgeschlossen werden und erfordert keine teure Ausrüstung. Darüber hinaus wurde die Machbarkeit des CRISPR-HBV-Assays zur HBV-B- und -C-Genotypisierung durch Validierung mit klinischen Proben erfolgreich bestätigt. Daher hat das CRISPR-HBV-System das Potenzial, ein POC-Diagnosetest zum Nachweis und zur Diagnose der HBV-Genotypen B und C in klinischen Anwendungen zu sein, insbesondere in Ländern mit unzureichenden medizinischen Ressourcen [92].

Da die Bildung eines intranukleären Reservoirs an cccDNA im Hepatozyten die Hauptursache für eine persistierende HBV-Infektion ist, haben Zhang, X et al. entwickelte hochempfindliche und spezifische Diagnosewerkzeuge für den Nachweis von HBV-cccDNA auf Basis der CRISPR-Cas13a-Technologie. Diese Technik umfasst die folgenden Schritte: (1) Verwendung plasmidsicherer ATP-abhängiger DNase (PSAD) und HindIII-Enzyme zum Verdauen von zirkulärer rcDNA und linearer doppelsträngiger DNA, (2) Amplifikation spezifischer HBV-cccDNA-Fragmente mittels Rolling Circle Amplification (RCA). ) und PCR und (3) Zielerkennung mit dem CRISPR-Cas13a-System. Dieser Assay kann 1 Kopie/µL HBV-cccDNA durch CRISPR/Cas13-unterstützte Fluoreszenzauslesung nachweisen. Darüber hinaus wurde dieser Assay durch die Durchführung von ddPCR, qPCR, RCA-qPCR, PCR-CRISPR und RCA-PCR-CRISPR für den Nachweis von cccDNA in HBV-assoziierten Lebergeweben, Plasma, Vollblut und mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) validiert ) [93].

Viele Studien haben gezeigt, dass im HBV-Genom auftretende Arzneimittelresistenzmutationen das Risiko einer HBV-Übertragung erhöhen oder eine aktive Replikation des Virusgenoms verursachen können, was bei betroffenen Patienten zu einer lytischen Infektion und anderen klinischen Problemen führt. Einer der wichtigsten Faktoren bei der Resistenz gegen antivirale Medikamente ist die Mutation im YMDD-Motiv des HBV-P-Gens. Daher haben Wang S. et al. entwickelte eine hochempfindliche und praktische Methode zum Nachweis von HBV-DNA und YMDD-Arzneimittelresistenzmutationen auf der Grundlage des CRISPR-Cas13a-Nachweissystems und der PCR-Amplifikation und bewertete ihre diagnostischen Fähigkeiten anhand klinischer Proben. Diese Technik bietet eine sehr hohe Empfindlichkeit für den Nachweis von HBV und die Identifizierung von Arzneimittelresistenzmutationen mittels konventioneller PCR. Da die PCR-Amplifikation stabiler ist als isotherme Amplifikationstechniken, wurde die PCR zur Zielamplifikation vor dem CRISPR-Cas13a-Nachweis eingesetzt. Hinsichtlich der Empfindlichkeit wurde festgestellt, dass mit dieser Technik eine Kopie pro Test auf HBV-DNA- und YMDD-Arzneimittelresistenzmutationen nachgewiesen werden kann [94]. In einer anderen Studie haben Ding, R et al. hat einen schnellen und empfindlichen HBV-POC-Test entwickelt, der auf LAMP-gekoppeltem CRISPR-Cas12a basiert. Dieser Assay löst auf kreative Weise das Problem der POC-Technik innerhalb von 10 Minuten, insbesondere das Problem der Nukleinsäureprobenextraktion. Basierend auf der Loop Isothermal Amplification (LAMP)-Cas12a erfolgt die Visualisierung der Testergebnisse sowohl mit Fluoreszenz- als auch mit Lateral-Flow-Teststreifen. Mit der Fluoreszenzauslesung kann eine hochempfindliche Echtzeiterkennung erreicht werden, während mit bloßem Auge sichtbare Ergebnisse mit der Lateral-Flow-Teststreifentechnologie erzielt werden können. Der auf Fluoreszenzauslesung basierende Cas12a-Assay kann einen HBV-Nachweis mit einer Empfindlichkeit von 1 Kopie/µL in 13 Minuten erreichen, während die Lateral-Flow-Teststreifentechnik nur 20 Minuten dauert. Die Auswertung klinischer Proben zeigt die Sensitivität und Spezifität sowohl der Fluoreszenz-Auslesemethode als auch des Lateral-Flow-Teststreifens zu 100 %. Darüber hinaus waren die Testergebnisse vollständig mit qPCR vergleichbar. Die auf LAMP-Cas12a basierende HBV-Technik erfordert minimale Ausrüstung und niedrige Kosten, um schnelle und genaue Testergebnisse zu liefern, und bietet dadurch ein erhebliches praktisches Potenzial für den POC-HBV-Nachweis in medizinisch unterversorgten Regionen (Tabelle 3) [95].

Die genetische Vielfalt von HCV und während der Replikation erzeugten Quasispezies hat zu einer viralen Resistenz gegen direkt wirkende antivirale Medikamente (DAAs) sowie zu Hindernissen bei der Entwicklung eines Impfstoffs geführt. Die genaue und rechtzeitige Diagnose einer Krankheit ist eine Voraussetzung für eine effiziente therapeutische Intervention und epidemiologische Überwachung [96]. Während Techniken wie Immunoassay und qPCR eine wichtige Rolle bei der Diagnose von HCV spielen, sind schnelle und genaue POC-Tests wichtig, um Personen mit HCV zu identifizieren, insbesondere in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen, in denen der Zugang oder die Verfügbarkeit molekularer Tests noch begrenzt ist. Um diese Lücke zu schließen, besteht daher die Notwendigkeit, einen neuen molekularen Assay für den schnellen Nachweis von HCV-RNA in Umgebungen mit begrenzten Ressourcen zu entwickeln [97]. Kürzlich haben Kham-Kjing et al. entwickelte und evaluierte eine schnelle und empfindliche Methode zum Nachweis von HCV-RNA. Die Methode basierte auf einem RT-LAMP-gekoppelten CRISPR-Cas12-System (RT-LAMP), das den Nachweis spezifischer HCV-Genomsequenzen ermöglicht. Verstärkte Produkte nach Spaltungsreaktionen können auf Lateral-Flow-Banden sichtbar gemacht oder mit einem Fluoreszenzdetektor gemessen werden. Beim Test an klinischen Proben von mit HCV, HIV oder HBV infizierten Personen oder von gesunden Spendern ergab der CRISPR-Cas12-Assay in Kombination mit RT-LAMP im Vergleich zur Referenzmethode, dem Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV-Test, 96 % Sensitivität, 100 % Spezifität und 97 % Übereinstimmung. Mit diesem Assay konnten HCV-RNA-Konzentrationen von nur 10 ng/µL nachgewiesen werden. Daher hat diese genaue und spezifische Technik das Potenzial, ein kostengünstiger und zuverlässiger POC-Test zur Identifizierung von Personen mit HCV in ressourcenarmen Umgebungen zu sein (Tabelle 3) [98].

Diese Gesamtstudien bewiesen das Potenzial des CRISPR/Cas-Systems als wirksames Diagnoseinstrument für Virushepatitis-Infektionen. Über diese oben beschriebenen Studien hinaus wurde bisher keine CRISPR-basierte Diagnosemethode zum Nachweis von HAV, HDV und HEV entwickelt. Allerdings ist das Cas12a-Enzym das Enzym der Wahl für die Entwicklung einer CRISPR-basierten Methode zum HAV-Nachweis. Da HDV ein RNA-Virus ist, ist Cas13a außerdem das Enzym der Wahl für die CRISPR-basierte Diagnosemethode für HDV. HEV ist wie HDV ein RNA-Virus, daher ist Cas13a das Enzym der Wahl für die CRISPR-basierte Diagnosemethode zum Nachweis dieses Virus. Unsicherheit, das Potenzial des CRISPR/Cas-Systems könnte bald zum führenden Diagnoseinstrument für verschiedene Virushepatitis-Infektionen werden.

Innerhalb weniger Jahre hat sich das CRISPR-basierte molekulare Diagnosesystem von einem experimentellen Werkzeug für die Nukleinsäure-Biosensorik zu einem klinisch realisierbaren Diagnosetest für den schnellen, erschwinglichen, empfindlichen und spezifischen Nachweis von Krankheitserregern, einschließlich Viren, am POC entwickelt. Obwohl diese Technologie viele Vorteile bietet, weist sie einige Herausforderungen und Einschränkungen auf, die für eine sichere und effiziente klinische Anwendung überwunden werden müssen. Die Haupteinschränkungen der meisten aktuellen CRISPR-Cas-basierten Diagnosetools, einschließlich SHERLOCK und DETECTR, sind ihre Abhängigkeit von der Voramplifikation der Zielnukleinsäuren entweder durch PCR oder isotherme Amplifikationsprozesse (z. B. PCR, RPA oder LAMP). Der isotherme Amplifikationsprozess erfordert jedoch häufig eine Reihe von Proteinen, wie z. Polymerase, Rekombinase oder Bindungsproteine ​​und Primer, einschließlich 2 Primer für RPA und 4 bis 6 Primer für LAMP sowie zusätzliche Probenvorbereitungsschritte, was die Testzeit erheblich verkompliziert und um 20 Minuten bis 2 Stunden verlängert [99]. Um dieses Problem zu lösen, wurden in den letzten Jahren verschiedene amplifikationsfreie Nachweismethoden wie digitales CRISPR, multiple crRNAs und hochempfindliche Signaltransduktionsverfahren für den direkten Nachweis nicht amplifizierter Proben entwickelt, mit denen ein schneller und hochempfindlicher Nachweis von Viren möglich ist. Allerdings erfordern diese Methoden auch spezielle Geräte wie teure fluoreszierende oder optische Detektionsinstrumente, Mikrofluidik-Chips usw., was ihre breite Anwendung einschränkt [100]. Es kann vorhergesagt werden, dass die zukünftige CRISPR/Cas-Technologieplattform weiterhin auf die Unterstützung anderer Technologien angewiesen sein wird. Durch die Kombination weiterer Signalauslesetechniken mit Nanomaterialien wird beispielsweise eine einfachere und empfindlichere Analyseleistung für vielfältigere Anwendungen der einzigartigen Funktionen des CRISPR/Cas-Systems erreicht.

Darüber hinaus wird die Benutzerfreundlichkeit der CRISPR-basierten Diagnostik durch optimierte Eintopfreaktionen und einfache Visualisierung der Testergebnisse verbessert. Die Probenvorbereitung erfordert jedoch immer noch einen separaten Schritt und Inkubationstemperaturen über Raumtemperatur erfordern Heizgeräte. Darüber hinaus erschweren Zielkonzentrationen nahe der niedrigsten Analytkonzentration (LOD) des Assays die sichere Quantifizierung des Messwerts, insbesondere bei Verwendung eines Lateral-Flow-Assays. Für den Einsatz zu Hause oder am Point-of-Care (POC) sollte das Assay-Design einfache Probenvorbereitungsprotokolle mit robusten Nachweismethoden kombinieren, um robuste Ergebnisse unter variablen oder anspruchsvollen Bedingungen zu liefern, wie z. B. Langzeitlagerung, begrenzte Benutzerschulung und raue Umgebungsbedingungen . Um dieses Ziel zu erreichen, wird die Integration von Probenvorbereitung, Messung und Berichterstellung in einzelne, einfach zu bedienende Einheiten mithilfe mikrofluidischer Techniken möglich [66]. Zukünftige Studien sollten sich auf die Entwicklung eines benutzerfreundlicheren, einstufigen Diagnoseansatzes konzentrieren, der die Freisetzung viraler Nukleinsäure, die Voramplifikation, den CRISPR-Cas-vermittelten Nachweis und die Signalauslesung umfasst.

Ein weiterer Nachteil von CRISPR-Cas-Systemen, insbesondere von Cas9, ist der „Off-Target“-Effekt, bei dem Cas9 zur Spaltung an unbeabsichtigte Genomstellen bindet. Ein solcher Off-Target-Effekt kann möglicherweise zu falsch negativen oder falschen Ergebnissen führen. Dieses Problem kann durch den Einsatz bioinformatischer Software zum Entwurf einer geeigneten sgRNA gelöst werden [101].

Automatisierung und künstliche Intelligenz können den Einsatz von CRISPR-Cas-Systemen in der Virusdiagnostik erheblich stärken. CRISPR-Cas-basierte Diagnosesysteme können mit künstlicher Intelligenz (KI) kombiniert werden, um ein Frühwarnsystem für die schnelle, kostengünstige, genaue und intelligente Erkennung eines Infektionserregers bereitzustellen. Insbesondere werden Krankenhäusern, Gesundheitszentren, Gemeinden oder sogar Einzelpersonen benutzerfreundliche und tragbare CRISPR-Cas-basierte Diagnosekits für den schnellen und genauen Nachweis spezifischer Krankheitserreger zur Verfügung gestellt. Der Smartphone-Abruf des Testergebnisses erfolgt über eine Anwendung. Über den 5G-Dienst können Daten von verschiedenen Orten in einem Cloud-Computing-System gespeichert und verarbeitet werden, auf das eingeschränktes Personal für Supportentscheidungen oder öffentlich für Forschungszwecke zugreifen kann. Das Cloud-Computing-System berechnet das Infektionsrisiko, um durch die Aktualisierung von Diagnoseelementen ein mit KI ausgestattetes Modell zu erstellen und dann politische Entscheidungsträger und Einzelpersonen zu warnen [102,103,104]. Ein solches CRISPR-Cas-Diagnose-KI-gestütztes Alarmsystem warnt frühzeitig vor dem Risiko infektiöser Viren in der Nähe und wäre sehr nützlich für eine rechtzeitige Reaktion und geeignete Maßnahmen zur Verhinderung der Ausbreitung viraler Infektionen.

Einschränkungen und Nachteile herkömmlicher Diagnosetechniken eröffnen neue Möglichkeiten für den Einsatz empfindlicher und effizienter molekulardiagnostischer Methoden zur schnellen Diagnose viraler Infektionen. CRISPR-basierte Systeme vom Typ II (Cas9), V (Cas12) und VI (Cas13) bieten fortschrittliche Diagnosewerkzeuge für die schnelle Erkennung und Bekämpfung von DNA- und RNA-Viren. Die Entwicklung neuer CRISPR-basierter Plattformen für die molekulare Diagnose von Virushepatitis verspricht, die Gesundheitsversorgung zu verändern und das epidemiologische Management dieser Infektionskrankheit weltweit zu verbessern. Derzeit müssen entwickelte CRISPR-basierte Tests durch klinische Studien validiert werden und die Testvalidierung sollte nach der klinischen Implementierung überwacht und aufrechterhalten werden, um ihre Leistung sicherzustellen. Trotz vieler erfolgreicher Entwicklungen der CRISPR-Cas-basierten Diagnoseplattform ist es vom Labor bis zur praktischen oder klinischen Anwendung noch ein weiter Weg.

Unzutreffend.

Herpes Simplex Virus

Cytomegalovirus

Epstein Barr Virus

Varicella-Zoster-Virus

Hepatitis-A-Virus

Hepatitis B Virus

Hepatitis-C-Virus

Hepatitis-Delta-Virus

Hepatitis-E-Virus

Hepatozelluläres Karzinom

Gehäufte, regelmäßig beabstandete kurze palindromische Wiederholungs-CRISPR-assoziierte Sequenzen

Punkt der Pflege

Polymerase Kettenreaktion

Techniken zur Nukleinsäureamplifikation

doppelsträngige DNA

kovalent geschlossene zirkuläre DNA

Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ I

Okkludierend

Claudin-I

Differenzierungscluster 81

Enzymimmunoassays

Chronische Hepatitis B

Fulminantes Leberversagen

Elektronenmikroskopie

quantitative PCR, NASBA: Nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation

Schleifenvermittelte isotherme Verstärkung

Ligase-Kettenreaktion

Reverse-Transkriptase-PCR

Digitale PCR

Sequenzierung der nächsten Generation

Nukleinsäuresequenzbasierte Amplifikation – CRISPR-Spaltung

Auf DNA-Endonuklease ausgerichteter CRISPR-Trans-Reporter

Spezifisches hochempfindliches enzymatisches Reporter-UnLOCKing

Protospacer-benachbartes Motiv

Einstündiges, kostengünstiges, hocheffizientes Mehrzwecksystem

Auffinden von Sequenzen mit geringer Häufigkeit durch Hybridisierung

West-Nil-Virus

Gelbfiebervirus

Schweres akutes respiratorisches Syndrom Coronavirus 2

Humane Papillomviren

Interferon-a

Nukleosidanaloga

Apolipoprotein B mRNA-editierendes katalytisches Polypeptid-ähnliches 3

Entspannte zirkuläre DNA

Prägenomische RNA

Mehrfache Crossover-Verschiebungsverstärkung

Plasmidsichere ATP-abhängige DNase

Rollkreisverstärkung

Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes

Isotherme Schleifenverstärkung

Direkt wirkende Virostatika

Interne ribosomale Eintrittsstelle.

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Diese Forschung wurde vom National Institute of Genetic Engineering and Biotechnology, Teheran, Iran, unterstützt.

Diese Forschung erhielt keine spezifischen Zuschüsse von Förderstellen im öffentlichen, kommerziellen oder gemeinnützigen Sektor.

Abteilung für Industrie-, Umwelt- und Biotechnologie, Nationales Institut für Gentechnik und Biotechnologie (NIGEB), Teheran, 1497716316, Iran

Howra Bahrulolum, Fatemeh Nouri Rouzbahani, Saghi Nooraei, Mehdi Mousavi Sameh und Gholamreza Ahmadian

Abteilung für Tierbiotechnologie, Nationales Institut für Gentechnik und Biotechnologie (NIGEB), Teheran, 1497716316, Iran

Hossein Tarrahimofrad

Forschungszentrum für Angewandte Mikrobiologie, Institut für Systembiologie und Vergiftungen, Medizinische Universität Baqiyatallah, Teheran, 1435916471, Iran

Abbas Hajizad

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GA hat die Studie entworfen. HB, HT, FNR, SN und MM schreiben Originalentwurf. HB hat die endgültige Fassung des Manuskripts verfasst. HB erstellte Abbildungen und Tabellen. GA und AH waren für die Prüfung und Bearbeitung des endgültigen Entwurfs verantwortlich. GA und AH trugen zur Projektverwaltung und -überwachung bei. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Gholamreza Ahmadian.

Unzutreffend.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Unzutreffend.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Bahrulolum, H., Tarrahimofrad, H., Rouzbahani, FN et al. Potenzial des CRISPR/Cas-Systems als neue Instrumente zur Erkennung einer Virushepatitis-Infektion. Virol J 20, 91 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02048-5

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Eingegangen: 4. Februar 2023

Angenommen: 23. April 2023

Veröffentlicht: 08. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12985-023-02048-5

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