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Jan 27, 2024

Multiomische Analyse zeigt, dass Lysosomen Retromer benötigen, um gesund zu bleiben

09.06.2023 Der Retromer-Komplex steuert die Sortierung, den Transport und den Transport von Proteinen

09. Juni 2023

Der Retromerkomplex steuert die Sortierung, den Transport und die Entsorgung von Proteinen über das Endolysosomensystem. Bei neurodegenerativen Erkrankungen geht es schief, doch wie das geschieht, bleibt unklar. Laut einer von Peter Cullen und James Daly an der britischen Universität Bristol durchgeführten Multiomics-Studie bricht der Stoffwechsel in Zellen zusammen, denen Retromer fehlt. In Nature Communications vom 29. Mai berichteten sie, dass Zellmembranproteine ​​falsch sortiert seien, Lysosomen mit unverdauter Fracht aufgebläht würden, die Autophagie zum Stillstand komme und sich Amyloid-Vorläuferproteine ​​anhäuften. Diese Sicherung veranlasst Lysosomen, überschüssigen Inhalt durch Exozytose aus der Zelle abzuleiten, was die Ausbreitung pathogener Proteine ​​wie Aβ-Aggregate von Zelle zu Zelle ermöglichen könnte.

„Es gibt eindeutige Beweise dafür, dass Retromer eine neuroprotektive Rolle bei neurodegenerativen Erkrankungen spielt. Dieses Manuskript untersucht die Komplexität der Retromerfunktion und wie sie bei der Neuroprotektion hilft“, sagte Cullen gegenüber Alzforum.

„Diese aufregende neue Arbeit der Cullen-Gruppe hat gerade große Fortschritte bei der Aufdeckung dieser Mechanismen gemacht“, kommentierte Jessica Young von der University of Washington, Seattle.

Retromer reguliert den endosomalen Recycling zur Zelloberfläche und deren retrograde Bewegung zum Golgi. Mutationen im Kern-Retromer-Protein VPS35 wurden mit AD und der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht (Rovelet-Lecrux et al., 2015; Nachrichten vom Juli 2011). Retromer ist im AD-Gehirn postmortal erschöpft, während in Zell- und Tiermodellen ein Mangel des Komplexes mit einer schlimmeren Aβ- und Tau-Pathologie korreliert (Small et al., 2005; Sullivan et al., 2011; Carosi et al., 2020).

Um systematisch zu untersuchen, was schief geht, wenn das Retromer deaktiviert ist, haben die Co-Erstautoren Daly und Chris Danson VPS35 in menschlichen Neurogliomzellen ausgeschaltet und dann mit LAMP1 auf Lysosomen und mit EEA1 auf frühe Endosomen gefärbt. In den Knockout-Zellen waren beide Organellen angeschwollen und verformt. Die Transmissionselektronenmikroskopie zeigte vergrößerte Endolysosomen, die mit unverdauten Membranstücken gefüllt waren (siehe Bild unten). Letzteres erinnerte an aufgeblähte Endolysosomen bei AD, PD und Lewy-Körper-Demenz (Cataldo et al., 2000; Shahmoradian et al., 2019; Crews et al., 2010).

Cullen und die Kommentatorin Julia TCW von der Boston University waren überrascht, dass das Targeting eines einzelnen Retromer-Proteins einen so auffälligen Phänotyp hervorrufen würde. Die Live-Zell-Bildgebung der Knockouts erfasste die gelegentliche und langsame Spaltung großer autophagischer Lysosomen. Durch diesen Vorgang nehmen die Organellen wieder ihre ursprüngliche Größe an, was die zahlreichen geschwollenen Organellen erklärt.

Vergrößerte Endolysosomen . Normale Lysosomen (rote Pfeile) und Endosomen (blaue Pfeile) sind klein und rund (links). Retromer-Knockout-Zellen (Mitte) enthielten riesige, verzerrte Endolysosomen (gelbe Pfeile), die mit Trümmern gefüllt waren (rechts). [Mit freundlicher Genehmigung von Daly et al., Nature Communications, 2023.]

Was lief in diesen Lysosomen schief? Die Wissenschaftler analysierten Proteome ganzer Zellen und isolierter Lysosomen. Im ersteren wurden 477 Lysosomen-assoziierte Proteine ​​angereichert und 246 abgereichert. Viele hydrolytische Enzyme wie Proteasen, Lipasen und Nukleasen waren vermindert, was auf eine verminderte Fähigkeit zum Abbau von Zellabfällen schließen lässt.

Die VSP35-negativen Lysosomen wurden mit mehreren hydrolytischen Rab-GTPasen gestapelt, die die lysosomale Exozytose und deren Fusion mit Endosomen und Autosomen regulieren. Dem lysosomalen Proteom fehlten auch alle Komponenten des BORC-Komplexes, Proteine, die die Organellen durch das Zytosol bewegen, indem sie sich an Mikrotubuli festsetzen.

Dimitrios Kapogiannis war besonders fasziniert von der Anhäufung von Proteinen, die an der APP-Verarbeitung und dem APP-Metabolismus beteiligt sind (Kommentar unten). Dies spiegelt einen Befund wider, der bei Mäusen beobachtet wurde, denen VPS35 in Hippocampus-Neuronen fehlt (Nachrichten vom Januar 2022).

Andere angereicherte lysosomale Proteine, die Netzwerken und Signalwegen zugeordnet sind, die an AD, Parkinson und anderen neurodegenerativen Erkrankungen beteiligt sind (Bild unten). Für die Autoren deuten diese Ergebnisse auf stagnierende, APP-gefüllte Lysosomen hin, die mit Endo- und Autosomen verschmolzen sind, es aber nicht geschafft haben, ihren Inhalt abzubauen oder in ihren ursprünglichen Zustand zurückzukehren.

Krankheiten Krankheiten. Viele in Lysosomen angereicherte Proteine ​​gelangten in Pfade, die mit neurodegenerativen Erkrankungen oder verwandten Prozessen in Zusammenhang stehen. [Mit freundlicher Genehmigung von Daly et al., Nature Communications, 2023.]

Blockierte Lysosomen wirkten sich sogar auf das Zelloberflächenproteom aus. Bei VSP35-Knockouts wurden die Transmembranproteine ​​dort abgereichert, wo sie hingehören – an der Membran –, aber dennoch in Lysosomen angereichert, was darauf hindeutet, dass die Wiederverwertung von Membranproteinen gesichert war. Andererseits sammelten sich lysosomale Proteine ​​wie LAMP1 und der Nieman-Pick-Typ-C-verknüpfte Cholesterintransporter NPCI an der Zelloberfläche, ebenso wie APP, β-Sekretase 2 und die C-terminalen APP-Fragmente, die BACE produziert. Die Autoren glauben, dass diese Verschiebungen, wo Proteine ​​in der Zelle landen, auf eine Lysosomen-Exozytose hinweisen.

Tatsächlich ergab die Messung des Proteoms der Zellmedien hohe Mengen an lysosomalen Proteinen, APP und anderen Substraten von Sekretasen. Die Autoren vermuten, dass die Exozytose der Lysosomen zunimmt, um die Abfallansammlung auszugleichen. Dies wiederum könnte die Ausbreitung pathogener Proteinaggregate von Zelle zu Zelle vorantreiben. Die Wissenschaftler glauben, dass Proteine ​​aus diesem „Sekretom“ flüssige Biomarker für Lysosomen-Dysfunktion sein könnten (siehe Nachrichten vom Dezember 2020). „Diese Daten deuten auf eine verstärkte Sekretion nicht nur von Lysosomen, sondern auch von konventionellen extrazellulären Vesikeln und autophagosomalen Zwischenprodukten hin“, bemerkte Tsuneya Ikezu, Mayo Clinic, Jacksonville, Florida (Kommentar unten).

Scott Small von der Columbia University, New York, glaubt, dass das Sekretom Aufschluss über den Crosstalk zwischen Zellen geben kann. „Ich denke, das Sekretom ist für neurodegenerative Erkrankungen am relevantesten, da der aus den Neuronen ausgestoßene endolysosomale Inhalt die Kommunikation mit Mikroglia und Astrozyten initiieren würde, und wir wissen, dass dies manchmal nach hinten losgehen kann“, sagte Small.

RNA versus Protein. Nur 14 Proteine ​​(blauer Text) wurden auf transkriptomischer und proteomischer Ebene in ganzen Zellen herunter- oder hochreguliert. [Mit freundlicher Genehmigung von Daly et al., Nature Communications, 2023.]

Die Transkriptomik ergab eine Diskrepanz zwischen Genexpression und Proteinkonzentration. Von den Hunderten von Proteinen, die durch die VPS35-Knockouts gestört wurden, wurden nur 14 auf Transkriptionsebene hoch- oder herunterreguliert (Bild oben). Das überraschte Cullen. Proteomik und Transkriptomik korrelieren nicht immer eng. Cullen glaubt, dass die Diskrepanz hier darauf hindeutet, dass die durch Retromer-Knockout verursachten Probleme im Proteinabbau und nicht in der Transkription liegen. Dass Gene, die für lysosomale Proteine ​​wie den Membranrezeptor Sortilin, NPC1 und die Protease Cathepsin D kodieren, hochreguliert wurden, obwohl sie nicht in Lysosomen auftraten, lassen auf Probleme beim Proteintransport schließen.

Alle morphologischen, proteomischen und transkriptomischen Veränderungen in den Retromer-Knockout-Endolysosomen wurden rückgängig gemacht, sobald VPS35 erneut exprimiert wurde. „Dies zeigt uns, dass die Veränderungen, die wir sehen, eine echte Widerspiegelung eines zielgerichteten Effekts der Retromer-Störung sind“, sagte Cullen.

Nach Ansicht von TCW macht dies Retromer als Wirkstoffziel interessant. „Viele kleine Moleküle aktivieren die Retromer-Funktion, und es wird wichtig sein, die wichtigsten vor- und nachgelagerten Proteine ​​oder Transkriptionsfaktoren herauszufinden, die die Retromer-Funktion steigern“, sagte sie gegenüber Alzforum (siehe Nachrichten vom Januar 2020). – Chelsea Weidman Burke

Der Zusammenhang des Multiprotein-Sortierkomplexes Retromer mit neurodegenerativen Erkrankungen wie AD und Parkinson ist seit langem bekannt. Die immense Komplexität des Signalwegs macht es jedoch schwierig, die Mechanismen dieser Assoziation zu analysieren.

Diese aufregende neue Arbeit der Cullen-Gruppe hat gerade große Fortschritte bei der Aufdeckung dieser Mechanismen gemacht. Durch die Verwendung von VPS35-KO-Zellen und die Durchführung einer lysosomalen Immunpräzipitation haben sie akribisch detaillierte Veränderungen in Proteinen festgestellt, die mit endolysosomalen Organellen und der Zelloberfläche verbunden sind. Die Daten deuten darauf hin, dass der Verlust des Retromers Zellstress fördern und zu Neurodegeneration führen könnte, da die Auflösung der Lysosomenmembrandynamik fehlschlägt und die lysosomale Exozytose zunimmt. Dadurch könnten potenziell pathogene Proteine ​​außerhalb der Zelle freigesetzt werden, wo sie zur Aggregation in benachbarten Zellen führen können.

Überraschenderweise deuten ihre Daten auch auf eine Rolle des Retromers bei der Regulierung der lysosomalen Identität hin, die, wenn sie nicht richtig erworben wird, zelluläre Stoffwechselprogramme verändern kann. In mehreren Studien wurden niedermolekulare Retromer-Chaperone zur Verbesserung von AD-Phänotypen eingesetzt (Mecozzi et al., 2014; Young et al., 2018; Mishra et al., 2022). Ein umfassenderes Verständnis der komplizierten Prozesse, die durch Retromere in der Zelle reguliert werden, wird sicherlich bei Studien hilfreich sein, die darauf abzielen, diesen Signalweg therapeutisch anzusprechen.

Mecozzi VJ, Berman DE, Simoes S, Vetanovetz C, Awal MR, Patel VM, Schneider RT, Petsko GA, Ringe D, Small SA.Pharmakologische Chaperone stabilisieren Retromer, um die APP-Verarbeitung zu begrenzen . Nat Chem Biol. 2014 Jun;10(6):443-9. Epub 20. April 2014 PubMed.

Young JE, Fong LK, Frankowski H, Petsko GA, Small SA, Goldstein LS. Die Stabilisierung des Retromer-Komplexes in einem menschlichen Stammzellmodell der Alzheimer-Krankheit reduziert die TAU-Phosphorylierung unabhängig vom Amyloid-Vorläuferprotein . Stammzellberichte. 13. März 2018;10(3):1046-1058. Epub 2018 1. März PubMed.

Mishra S, Knupp A, Kinoshita C, Martinez R, Theofilas P, Young JE. Pharmakologische Stabilisierung von Retromeren rettet endosomale Pathologie, die durch Defekte im Alzheimer-Gen SORL1 verursacht wird.2022 Aug 02 10.1101/2022.07.31.502217 (Version 1) bioRxiv.

Retromer-Anomalien wurden mit der Pathogenese der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht, die genauen Mechanismen bleiben jedoch unklar. Diese neue Studie von Daly et al. bietet wertvolle neue Erkenntnisse durch die Verknüpfung von Retromeren mit der Gesundheit des endolysosomalen Systems; Insbesondere zeigt die Studie, wie H4-Neurogliomzellen, die für die Kernkomponente VPS35 von Retromer ausgeschaltet wurden, eine Reihe morphologischer Veränderungen im endolysosomalen System zeigen, die denen bei AD ähneln.

Ich bin besonders fasziniert von dem proteomischen Befund einer Anreicherung von Proteinen, die an der APP-Verarbeitung beteiligt sind, einschließlich einer Akkumulation von APP in VPS35-KO-Lysosomen sowie einer abnormalen Akkumulation von gespaltenem APP, was darauf hindeutet, dass Retromer-Anomalien der Aβ-Akkumulation vorgeschaltet sein könnten.

Die Studie weist jedoch ihre Grenzen auf, insbesondere aufgrund der Tatsache, dass das Hauptmodell eine neoplastische Zelllinie ist, die Ereignisse in normalen Neuronen möglicherweise nicht vollständig nachbildet (obwohl die Autoren versucht haben, die physiologische Relevanz ihres Modells mithilfe primärer Neuronen aus dem Mauskortex festzustellen). mit Plasmiden der miRNA Vps35-BFP transfiziert und ähnliche morphologische Veränderungen beobachtet).

Ich habe auch das Gefühl, dass eine Chance verpasst wurde, indem man nicht extrazelluläre Vesikel aus dem Kulturüberstand isolierte und ihr Proteom analysierte. Da viele exosomale Proteine ​​durch proteomische Analyse dieses Überstands identifiziert wurden, wäre es aufschlussreich gewesen zu wissen, welche Proteine ​​EV-assoziiert sind und welche nicht.

Alles in allem ist dies eine interessante und möglicherweise wirkungsvolle Studie, die neue Erkenntnisse liefert und neue Hypothesen motiviert.

Hierbei handelt es sich um eine äußerst umfassende, zellbasierte Studie, die multiomische Ansätze verwendet, um zu verstehen, wie ein Vps35-Mangel zur Anhäufung lysosomaler Komponenten führt. Die Verwendung von HA-markiertem Tmem192 für die lysosomale Markierung zur Durchführung von LysoIP ist ein neuartiger Ansatz, der uns zusammen mit der herkömmlichen Ganzzell-Proteomik, Transkriptomik und Proteomik biotinylierter Proteine ​​auf der Zelloberfläche und im „Sekretom“ des Wachstumsmediums liefert ein riesiger Datensatz für eine integrierte Omics-basierte Analyse.

Neben vielen faszinierenden Erkenntnissen war es sehr interessant zu erfahren, dass Rab27b eines der am stärksten angereicherten Proteine ​​in der Zelle und in Lysosomen ist. Rab27b ist ein entscheidender Regulator für die Sekretion extrazellulärer Vesikel (EV) (Ostrowski et al., 2010) und kann auch die nicht-exosomale Sekretion von a-Synuclein regulieren (Underwood et al., 2020). Diese Studie konzentrierte sich auf die durch Vps35-Deletion verursachte lysosomale Akkumulation, aber der Datensatz zeigt auch eine Anreicherung der klassischen EV-Marker CD9 und CD81 in Lysosomen, CD9 in Wachstumsmedien und mehrerer anderer Tetraspanine (TSPAN4, TSPAN6) auf der Zelloberfläche. Diese Daten deuten auf eine verstärkte Sekretion nicht nur von Lysosomen, sondern auch von konventionellen EV- und autophagosomalen Zwischenprodukten hin.

Die Proteinzusammensetzung des Lysosoms von Vps35-KO-Zellen zeigt auch eine signifikante Anreicherung von APP-C-terminalen Fragmenten und APP-verarbeitenden Enzymen, die auch in aus dem Gehirn stammenden EVs zu finden ist (Perez-Gonzalez et al., 2012; Muraoka et al., 2020). ). TSPAN6 ist im Gehirn von Alzheimer-Patienten erhöht und spielt eine Rolle bei der Sortierung des C-terminalen Fragments in die durch Exosomen vermittelte Sekretion (Guix et al., 2017) und kann auch an der Akkumulation des C-terminalen Fragments im Gehirn beteiligt sein Lysosom von Vps35-KO-Zellen. Angesichts der auffälligen Überlappung der pathogenen Proteine, die im dysfunktionalen Lysosom und in dystrophischen Neuriten gefunden werden, legt die Studie nahe, dass Vps35 eine entscheidende Rolle bei der Bildung dystrophischer Neuriten rund um Amyloidplaques spielt, wie in menschlichen AD-Gehirn- und Mausmodellen für Amyloidose zu sehen ist.

Ostrowski M, Carmo NB, Krumeich S, Fanget I, Raposo G, Savina A, Moita CF, Schauer K, Hume AN, Freitas RP, Goud B, Benaroch P, Hacohen N, Fukuda M, Desnos C, Seabra MC, Darchen F , Amigorena S, Moita LF, Thery C. Rab27a und Rab27b kontrollieren verschiedene Schritte des Exosomen-Sekretionswegs . Nat Cell Biol. 2010 Jan;12(1):19-30; sup S. 1-13. Epub 6. Dezember 2009 PubMed.

Underwood R, Wang B, Carico C, Whitaker RH, Placzek WJ, Yacoubian TA. Die GTPase Rab27b reguliert die Freisetzung, autophagische Clearance und Toxizität von α-Synuclein . J Biol. Chem. 5. Juni 2020;295(23):8005-8016. Epub 29. April 2020 PubMed.

Perez-Gonzalez R, Gauthier SA, Kumar A, Levy E. Der Exosom-Sekretionsweg transportiert carboxylterminale Fragmente des Amyloid-Vorläuferproteins von der Zelle in den extrazellulären Raum des Gehirns . J Biol. Chem. 14. Dezember 2012;287(51):43108-15. PubMed.

Muraoka S, DeLeo AM, Sethi MK, Yukawa-Takamatsu K, Yang Z, Ko J, Hogan JD, Ruan Z, You Y, Wang Y, Medalla M, Ikezu S, Chen M, Xia W, Gorantla S, Gendelman HE, Issadore D, Zaia J, Ikezu T. Proteomische und biologische Profilierung extrazellulärer Vesikel aus menschlichen Gehirngeweben mit Alzheimer-Krankheit . Alzheimer-Demenz. 2020 Jun;16(6):896-907. Epub 2020 17. April PubMed.

Guix FX, Sannerud R, Berditchevski F, Arranz AM, Horré K, Snellinx A, Thathiah A, Saido T, Saito T, Rajesh S, Overduin M, Kumar-Singh S, Radaelli E, Corthout N, Colombelli J, Tosi S, Munck S, Salas IH, Annaert W, De Strooper B. Tetraspanin 6: ein zentrales Protein des multiplen Vesikelkörpers, das die Exosomenfreisetzung und den lysosomalen Abbau von Amyloid-Vorläuferproteinfragmenten bestimmt . Mol Neurodegener. 10. März 2017;12(1):25. PubMed.

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