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Jul 08, 2023

Untersuchung der möglichen Rolle von Defensinen bei der unterschiedlichen Vektorkompetenz von Körper- und Kopfläusen für Bartonella quintana

Parasiten und Vektoren

Parasites & Vectors Band 16, Artikelnummer: 183 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die Körper- und Kopfläuse des Menschen sind Artgenossen, aber nur die Körperlaus fungiert als Vektor zur Übertragung bakterieller Krankheitserreger wie Bartonella quintana. Beide Laus-Unterarten verfügen nur über zwei antimikrobielle Peptide, Defensin 1 und Defensin 2. Folglich können Unterschiede in den molekularen und funktionellen Eigenschaften dieser beiden Laus-Unterarten für die unterschiedliche Vektorkompetenz zwischen ihnen verantwortlich sein.

Um die molekulare Grundlage der Vektorkompetenz aufzuklären, verglichen wir Unterschiede in den strukturellen Eigenschaften und Transkriptionsfaktor-/microRNA-Bindungsstellen der beiden Defensine bei Körper- und Kopfläusen. Antimikrobielle Aktivitätsspektren wurden auch mit rekombinanten Laus-Defensinen untersucht, die über Baculovirus exprimiert wurden.

Die Aminosäuresequenzen in voller Länge von Defensin 1 waren in beiden Unterarten identisch, wohingegen die beiden Aminosäurereste in Defensin 2 zwischen den beiden Unterarten unterschiedlich waren. Rekombinante Laus-Defensine zeigten antimikrobielle Aktivitäten nur gegen den repräsentativen grampositiven Staphylococcus aureus, nicht jedoch gegen gramnegative Escherichia coli oder den Hefepilz Candida albicans. Sie zeigten jedoch eine beträchtliche Aktivität gegen B. quintana, wobei das Defensin 2 der Körperlaus deutlich weniger wirksam war als das Defensin 2 der Kopflaus. Eine regulatorische Sequenzanalyse ergab, dass die Geneinheiten von Defensin 1 und Defensin 2 in Körperläusen eine verringerte Anzahl an Transkriptionen aufweisen Faktor-Bindungsstellen, aber eine erhöhte Anzahl von microRNA-Bindungsstellen, was auf relativ geringere Transkriptionsaktivitäten von Körperlaus-Defensinen schließen lässt.

Die deutlich geringeren antibakteriellen Aktivitäten von Defensin 2 tragen zusammen mit der verringerten Wahrscheinlichkeit der Defensinexpression bei Körperläusen wahrscheinlich zu einer geschwächten Immunantwort auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von B. quintana bei, was zu einer höheren Vektorkompetenz von Körperläusen im Vergleich zu Kopfläusen führt.

Die menschliche Körperlaus Pediculus humanus humanus und die Kopflaus P. h. capitis sind hämatophage Ektoparasiten, die ihren gesamten Lebenszyklus auf menschlichen Wirten verbringen und sich von menschlichem Blut ernähren. Der Befall mit menschlichen Kopfläusen verursacht wirtschaftliche und soziale Probleme, während der Befall mit menschlichen Körperläusen die öffentliche Gesundheit gefährdet, indem er bakterielle Krankheiten überträgt [1]. Es wird angenommen, dass sich die Körperlaus vor 40.000–70.000 Jahren, als der Mensch begann, Kleidung zu tragen, aus einer Artgenossen der Kopflaus entwickelt hat [2] und über eine höhere Vektorkompetenz als die Kopflaus verfügt. Von diesen beiden Läusearten ist nur die Körperlaus dafür bekannt, gramnegative bakterielle Krankheitserreger zu übertragen, darunter Bartonella quintana, Rickettsia prowazekii und Borrelia recurrentis, die Grabenfieber, epidemischen Typhus bzw. Rückfallfieber verursachen. Es ist jedoch nicht bekannt, dass die Kopflaus bakterielle Krankheiten auf den Menschen überträgt, was wahrscheinlich auf die im Vergleich zur Körperlaus stärkere Immunantwort zurückzuführen ist [3,4,5].

Eine genomweite Analyse repräsentativer immunbezogener Gene sowohl bei Körper- als auch bei Kopfläusen ergab einen gemeinsamen Satz von 93 Genen, was auf ein deutlich geschrumpftes Immunsystem bei menschlichen Läusen im Vergleich zu anderen Insekten hinweist [3]. Die Anzahl der mit dem humoralen Immunsystem verbundenen Gene ist bei menschlichen Läusen erheblich reduziert, wobei einige Immungene im menschlichen Lausgenom fehlen [3, 6]. Es wird vermutet, dass dieses vereinfachte Immunsystem bei menschlichen Läusen auf ihren parasitären Lebenszyklus zurückzuführen ist, in dem sie sich ausschließlich von menschlichem Blut ernähren und Blut als relativ sterile Nahrung gilt. Interessanterweise wurden nur zwei antimikrobielle Peptide (AMPs), nämlich Defensin 1 und Defensin 2, im Genom von Körper- und Kopfläusen des Menschen identifiziert [3]. Eine vergleichende Transkriptomanalyse ergab, dass sowohl Körper- als auch Kopfläuse praktisch den gleichen genetischen Hintergrund haben [7], was darauf hindeutet, dass die offensichtlichen Unterschiede in der Vektorkompetenz zwischen diesen beiden Läusearten auf die unterschiedlichen Transkriptionsprofile immunbezogener Gene zurückzuführen sein könnten, wie z die Defensine. Es wurde festgestellt, dass die basalen Transkriptionsniveaus von Defensin 1 und Defensin 2 im Gewebe des Verdauungstrakts von Kopfläusen signifikant höher sind als im Gewebe von Körperläusen [4]. Darüber hinaus konnte die Defensin-1-Expression nach einer oralen Exposition mit B. quintana im Gewebe des Verdauungstrakts der Kopflaus induziert werden, nicht jedoch bei der Körperlaus [5]. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass die verstärkten Immunantworten, die durch die konstitutive und induzierbare Expression der Defensine 1 und 2 vermittelt werden, zur verringerten Vektorkompetenz in der Kopflaus beitragen.

Trotz der Bedeutung von Laus-Defensinen für Immunantworten und Vektorkompetenz bei menschlichen Läusen gibt es nur wenige detaillierte Informationen zu den strukturellen Eigenschaften und Funktionen dieser AMPs. Es muss noch geklärt werden, wie die Defensinexpression unterschiedlich reguliert wird und ob es einen Unterschied in der antimikrobiellen Aktivität von Defensinen zwischen Körper- und Kopfläusen gibt. Darüber hinaus muss die Wirksamkeit von Laus-Defensinen gegen pathogene Bakterien wie B. quintana noch bestimmt werden.

In dieser Studie haben wir die molekularen und funktionellen Eigenschaften von Laus-Defensinen charakterisiert. Die potenziellen Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen und microRNA (miRNA)-Bindungsstellen für Laus-Defensine wurden zwischen Körper- und Kopfläusen verglichen, um ihre unterschiedlichen Expressionsprofile zwischen den Unterarten aufzuklären. Unter Verwendung von in vitro exprimiertem rekombinantem Defensin 1 und Defensin 2 wurden die antimikrobiellen Aktivitätsspektren von Laus-Defensinen bestimmt und zwischen Körper- und Kopfläusen verglichen. Die in dieser Studie präsentierten Daten sollen ein tiefgreifendes Verständnis der durch die Defensine 1 und 2 vermittelten unterschiedlichen Vektorkompetenz zwischen Körper- und Kopfläusen ermöglichen.

Der Stamm der Körperlaus aus San Francisco und der Stamm der Kopflaus aus Südflorida wurden in einem In-vitro-Membranfütterungssystem [8] unter kontrollierten Bedingungen von 30 °C, 70–80 % relativer Luftfeuchtigkeit und 16/8 Stunden Licht/Dunkelheit gezüchtet in Aufzuchtkammern (Institutional Review Board Nr. E2211/001–003).

Defensin-komplementäre DNA-Sequenzen (cDNA-Sequenzen) von Körper- und Kopfläusen wurden vom National Center for Biotechnology Information (NCBI; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) und einer früheren Veröffentlichung [6] bezogen und von bestätigt das Klonen und Resequenzieren von cDNA aus dem Stamm der Körperlaus aus San Francisco und dem Stamm der Kopflaus aus Südflorida. Aminosäuresequenzen von Defensinen von 38 Insektenarten wurden mithilfe des Analysepakets CLC Main Workbench 8 (CLC Bio, Waltham, MA, USA) abgeglichen. Ein phylogenetischer Baum wurde mit MEGA Die Zahl an jedem Knoten des Baums gibt den Prozentsatz der Bootstrap-Werte basierend auf 1000 Pseudoreplikaten an. Eine dreidimensionale (3D) Strukturmodellierung von Defensinen wurde auf der Grundlage der Strukturen der Peptide Insekten-Defensin A [9] und Anopheles-Defensin [10] in der Proteindatenbank durchgeführt. Die Sequenzen der Laus-Gene wurden zur Strukturvorhersage an den Molekularmodellierungsserver des SWISS-MODEL (Automated Comparative Protein Modeling Server) [11] übermittelt und 3D-Strukturen wurden mit dem UCSF-Chimera-Programm analysiert [12]. Die Spaltstelle des Signalpeptids, die Hydrophobie, das Molekulargewicht, der isoelektrische Punkt (pI) und die Nettoladung bei pH 7 wurden mithilfe des SignalP 6.0-Servers (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP) vorhergesagt [ 13], ProtScale-Tool (https://web.expasy.org/protscale/) [14], Compute pI/MW-Tool (https://web.expasy.org/compute_pi/) [14] und Peptideigenschaftsrechner ( https://pepcalc.com/). Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen in der 5'-Upstream-Region von Genen wurden mithilfe des Motiverkennungsprogramms PROMO (http://alggen.lsi.upc.es/) vorhergesagt. Die mutmaßliche 1000-bp-regulatorische Region des Zielgens (800 bp stromaufwärts plus 200 bp stromabwärts gelegene genomische DNA-Sequenzen von der Transkriptionsstartstelle) wurde zur Vorhersage der Transkriptionsfaktor-Bindungsstelle verwendet. Die Sequenzen wurden aus der Vektorbasis (http://www.vectorbase.org) und den Genomsequenzierungsdaten der Kopflaus [6] für Körper- bzw. Kopfläuse erhalten. Die 3'-untranslatierten Regionen (UTRs) in den Transkripten der Defensine 1 und 2 von Körper- und Kopfläusen wurden für die miRNA-Vorhersage mithilfe der miRNA-Sequenzdatenbank miRBase (http://mirbase.org) verwendet (15). Der E-Wert-Grenzwert lag bei 10 und die Arthropoden-miRNA-Sequenzdatenbank wurde für spezifische Vorhersagen verwendet.

Die Gesamt-RNA von fünf Körper- und Kopfläusen wurde unter Verwendung von 200 μl TRI-Reagenz (Molecular Research Center, Cincinnati, OH, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Um DNA-Kontaminationen aus der Gesamt-RNA zu entfernen, wurde DNase I (Takara Bio, Kyoto, Japan) behandelt und cDNA unter Verwendung der Reverse Transkriptase SuperScript IV (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) mit Oligo-dT-Primern synthetisiert. Die Signalpeptid- und reifen Peptidregionen der Defensine 1 und 2 der Körperlaus und Defensin 2 der Kopflaus wurden separat unter Verwendung genspezifischer Primer (Zusatzdatei 1: Tabelle S1) mit Advantage Taq (Clontech, Palo Alto, CA, USA) amplifiziert. USA). Diese wurden dann zusammen mit komplementären einzelsträngigen Primern, die einen 6× His-Tag enthielten, in den pBacPAK8-Vektor (Clontech) eingefügt. Die Plasmidsequenzen für jeden Klonierungsschritt wurden durch DNA-Sequenzierung (Macrogen, Seoul, Korea) verifiziert. Defensine enthaltende Transfervektoren wurden mit BacPAK6-DNA (Clontech) in Sf9-Zellen (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) co-transfiziert, die in TC-100-Medium (WelGENE, Gyeongsan, Korea), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (WelGENE), bei 27 °C kultiviert wurden C (Zusatzdatei 2: Tabelle S2). Nach 5 Tagen Transfektion mit Bacfectin-Reagenz (Clontech) wurde der Überstand von den infizierten Zellen gesammelt und als Virusstamm verwendet. Der erste Virusstamm wurde auf 5 × 106 Sf9-Zellen ausgesät, und der Überstand wurde nach 3 Tagen Infektion durch 15-minütige Zentrifugation bei 3300 U/min bei 4 °C gesammelt. Der Überstand wurde unter Verwendung einer Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit-3 kDa (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) durch 40-minütige Zentrifugation bei 7500 × g und 4 ° C konzentriert. Der konzentrierte Überstand wurde in eine 5-ml-HisTrap-HP-Affinitätssäule (GE Healthcare, Pittsburgh, PA, USA) geladen und mit einem Bindungspuffer (50 mM NaH2PO4 und 300 mM NaCl, enthaltend 5 mM Imidazol, pH 8,0) bei einer Durchflussrate äquilibriert von 5 ml/min mit AKTAprime plus FPLC (GE Healthcare). Die 5-ml-HisTrap-HP-Affinitätssäule wurde mit 40 ml Waschpuffer (50 mM NaH2PO4 und 300 mM NaCl, enthaltend 10 mM Imidazol, pH 8,0) gewaschen und mit Elutionspuffer (50 mM NaH2PO4 und 300 mM NaCl, enthaltend 250 mM Imidazol, pH 8,0) eluiert. pH-Wert 8,0). Fraktionen mit Elutionspeaks wurden gesammelt und unter Verwendung einer Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit-3 kDa (MilliporeSigma) durch Zentrifugation bei 7500 × g für 40 Minuten bei 4 °C konzentriert, und der Puffer wurde mit 100 mM Tris-HCl (20) ausgetauscht mM NaCl, pH 7,8) Puffer zur Reduzierung der Imidazolkonzentration. Die Konzentration der gereinigten Peptidprobe wurde unter Verwendung des Pierce BCA Protein Assay Kit (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) mit Rinderserumalbumin als Standardprotein quantifiziert.

Gramnegative Escherichia coli (American Type Culture Collection [ATCC] Nr. 11775), grampositiver Staphylococcus aureus (ATCC Nr. 12600) und grampositive Hefe Candida albicans (ATCC Nr. 10231) wurden in Luria-Bertani-Brühe kultiviert. Hirn-Herz-Infusionsbrühe bzw. Kartoffel-Dextrose-Brühe bei 200 U/min in einem Schüttelinkubator bei 37 °C über Nacht, anschließend wurden die kultivierten Bakterien in derselben Kulturbrühe um das 100-fache verdünnt. Nachdem die optische Dichte 0,5 bei 600 nm (OD600) erreicht hatte, wurden jeweils 10 μl Aliquots der rekombinanten Defensine 1 und 2 in verschiedenen Konzentrationen mit jeweils 90 μl Bakterienkultur in einer 96-Well-Platte in einem Schüttelinkubator bei 37 °C inkubiert 200 U/min über Nacht. Als Negativkontrolle wurde Tris-HCl-Puffer verwendet. Die OD600-Werte wurden mit einem VersaMax-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices, San Jose, CA, USA) gemessen. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC50) wurde mit GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) berechnet und antimikrobielle Aktivitätstests wurden mit drei Wiederholungen durchgeführt.

Der Wildtyp-Stamm B. quintana JK31, der ursprünglich von Dr. Jane Koehler (University of California, San Francisco, CA, USA) erhalten wurde, wurde in einer Einrichtung der Biosicherheitsstufe 2 an der Seoul National University (LML08-1090) gehalten. Gefrorene Bestände von B. quintana wurden auf einer Schokoladenagarplatte in einem Kerzenlöschgefäß 10 Tage lang bei 37 °C kultiviert und für weitere 7 Tage zur Kultivierung auf eine frische Agarplatte gegeben. Kultivierte B. quintana-Zellen wurden geerntet und mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) durch 4-minütige Zentrifugation bei 1000 × g gespült. Nach zwei weiteren Spülungen wurden die Pellets in 100 μl PBS resuspendiert. Aliquote von 5 μl der 100 μl Bakteriensuspension wurden seriell mit PBS verdünnt; Anschließend wurden 12 μl jeder 1000-fach verdünnten Bakteriensuspension gründlich mit 12 μl 100 μM Gentamicin als Positivkontrolle, 100 mM Tris-HCl-Puffer als Negativkontrolle und 100 μM rekombinanten Defensinen 1 und 2 aus der Körperlaus oder Defensin vermischt 2 von der Kopflaus. Insgesamt 8 μl der Mischung wurden dreimal auf eine Schokoladenagarplatte getropft und die Anzahl der koloniebildenden Einheiten (KBE) nach 10-tägiger Inkubation in einem Kerzenlöschgefäß bei 37 °C berechnet. Der Kolonieindex wurde durch Division der KBE/μl durch KBE/μl der Negativkontrolle ermittelt.

Die hämolytischen Aktivitäten der rekombinanten Defensine 1 und 2 aus der Körperlaus und des Defensins 2 aus der Kopflaus wurden mithilfe menschlicher roter Blutkörperchen (RBCs) wie zuvor beschrieben bewertet [16]. Erythrozyten wurden dreimal 15 Minuten lang bei 960 U/min mit PBS gewaschen und dann in PBS mit einer Konzentration von 2 % resuspendiert. Aliquots von 10 μl rekombinanter Defensine in vier Konzentrationen (10, 20, 50 und 100 μM) und Antibiotika in fünf Konzentrationen (10, 20, 50, 100 und 200 μM) wurden jeweils mit 90 μl Erythrozyten 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert °C und 15 Minuten lang bei 960 U/min zentrifugiert. Die OD540 des Überstands wurde mit einem VersaMax-Mikroplattenlesegerät (Molecular Devices) gemessen und die relativen hämolytischen Aktivitäten von Tris-HCl-Puffer und 0,1 % Triton X-100 wurden mit 0 % bzw. 100 % angenommen. Hämolysetests wurden mit drei Wiederholungen durchgeführt und das Protokoll wurde vom Institutional Review Board (Institutional Review Board Nr. E2211/001–003) genehmigt.

Zu jedem Zeitpunkt wurden alle experimentellen Daten dreifach erfasst. Eine einfaktorielle Varianzanalyse mit Tukeys Mehrfachvergleichstest und ungepaarten T-Tests wurde verwendet, um signifikante Unterschiede durch Interpretation von P-Werten zu bestimmen. Die statistische Signifikanz wurde auf P <0,05 festgelegt und die statistische Analyse wurde mit der GraphPad Prism 6.01-Software (GraphPad Software) durchgeführt.

Die Defensine 1 und 2 der Körper- und Kopfläuse wurden mit der CLC Main Workbench 8 (Qiagen, Hilden, Deutschland) abgeglichen (Abb. 1). Die offenen Leserahmensequenzen (ORF) von Körperlaus-Defensin 1 (BLDef1) und Kopflaus-Defensin 1 (HLDef1) stimmten vollständig mit der Referenz-BLDef1-Sequenz (Zugangsnummer: XP_002428138.1) überein. BLDef1 und HLDef1 waren identisch und bestanden aus 109 Aminosäuren, darunter ein 20 Aminosäuren langes Signalpeptid, ein 46 Aminosäuren langes Propeptid und eine 43 Aminosäuren lange reife Peptidregion. Die ORF-Sequenz von Körperlaus-Defensin 2 (BLDef2) war völlig identisch mit der Referenzsequenz (Zugangsnummer: XP_002432619.1), unterschied sich jedoch geringfügig von der Kopflaus-Defensin-2-Sequenz (HLDef2). Im Vergleich zur 116 Aminosäuren langen HLDef2-Sequenz bestand BLDef2 aufgrund der Deletion eines Cysteinrests in der Signalpeptidregion und zweier Reste (Lysin und Glutaminsäure) in der Propeptidregion aus 113 Aminosäuren; Darüber hinaus wurden zwei Aminosäuresubstitutionen zwischen BLDef2 und HLDef2 gefunden: eine in der Propeptidregion (Glutamin an Aminosäureposition 29 für BLDef2 vs. Arginin an Aminosäureposition 30 für HLDef2) und die andere in der reifen Peptidregion (Tyrosin an Aminosäureposition 105 für BLDef2 und Asparaginsäure an Aminosäureposition 108 für HLDef2). Der radikale Aminosäureaustausch von Asparaginsäure durch Tyrosin im reifen Peptid von BLDef2 implizierte die Möglichkeit unterschiedlicher biologischer Aktivitäten zwischen BLDef2 und HLDef2.

Übereinstimmungen der Aminosäuresequenzen von Defensin 1 und Defensin 2 von Körper- und Kopfläusen sowie anderen blutsaugenden Insekten, einschließlich der Katzenfloh- und Hemipterenarten. Der Pfeil zeigt den Startpunkt reifer Peptidregionen an, Sternchen zeigen die Dipeptid-Spaltungsstelle für Trypsin-ähnliche Proteasen an, offene Dreiecke zeigen verschiedene Aminosäuren zwischen BLDef2 und HLDef2 an, gefüllte Dreiecke zeigen die konservierten sechs Cysteinreste an. Die Sequenzen von BLDef1 (XP_002428138.1) und BLDef2 (XP_002432619.1) wurden aus der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) bezogen. BL, Körperlaus; Def1, Defensin 1; Def2, Defensin 2; Vgl. Ctenocephalides felis; Cl, Cimex lectularius; HL, Kopflaus; Rp, Rhodnius prolixus

Konservierte Dipeptid-Spaltungsstellen (-RR- und -KR- in Defensinen der menschlichen Laus bzw. anderer Insekten) für Trypsin-ähnliche Proteasen wurden zwischen der Propeptid- und der reifen Peptidregion gefunden [17], und sechs konservierte Cysteinreste waren darin vorhanden die reifen Peptidregionen aller untersuchten Defensine (Abb. 1). Der Startpunkt der reifen Peptidregionen in allen Defensinen enthielt Alanin- und Threoninreste (-AT-), mit Ausnahme von Defensin 1 und 2 des Katzenflohs (-VT-). Die C-terminale Region aller untersuchten Defensine zeigte eine hohe Konservierung von zwei basischen Resten, entweder Arginin-Arginin (RR) oder Arginin-Lysin (RK). Die Sequenzähnlichkeiten reifer Peptide in den Defensinen 1 und 2 waren bei den untersuchten Insektenarten relativ höher (51,2–72,1 % bzw. 60,5–66,7 %) im Vergleich zu den Sequenzen voller Länge (33,3–46 % bzw. 31,9–35,9 %). jeweils).

Die Defensine 1 und 2 von 33 Insektenarten (2 Phthiraptera, 6 Diptera, 14 Hymenoptera, 5 Hemiptera, 3 Coleoptera, 1 Siphonaptera, 1 Thysanoptera, 1 Orthoptera) stimmten mit denen von Körperläusen und den Defensinen 1 und 2 von 46 Insektenarten überein (2 Phthiraptera, 5 Diptera, 30 Hymenoptera, 4 Hemiptera, 2 Coleoptera, 2 Lepidoptera, 1 Siphonaptera) wurden mit denen von Kopfläusen in Einklang gebracht (Zusatzdatei 3: Abbildung S1). Die reifen Peptidregionen der Defensine von Insektenarten zeigten höhere Sequenzähnlichkeiten als die der 5'-Sequenzen. Insbesondere waren sechs Cysteinreste in den meisten reifen Peptidregionen konserviert, was zeigt, dass die sechs Cysteinreste eines der repräsentativen Strukturmotive in den meisten Insektendefensinen sind. Im Stammbaum gruppierten sich die Defensine 1 und 2 von Körper- und Kopfläusen mit den Defensinen 1 und 2 des Katzenflohs Ctenocephalides felis (Siphonaptera), trotz der taxonomischen Distanz zwischen Läusen und Flöhen (Abb. 2).

Phylogenetischer Baum der Defensine aus Insektenarten. Das rot gepunktete Kästchen zeigt die Klade der Laus-Defensine an. Die phylogenetische Analyse wurde unter Verwendung der Maximum-Likelihood-Methode basierend auf dem Jones-Taylor-Thornton-Modell (JTT) mit 1000 Bootstrap-Replikationen durchgeführt. Die Prozentsätze der Bootstrap-Werte werden auf jedem Knoten des Baums dargestellt. D, Diptera; Ich, Ixodida; S, Siphonaptera; P, Phthiraptera; H, Hemiptera

BLDef1 und HLDef1 besaßen die geringste Anzahl positiv geladener Aminosäuren (14) und zeigten daher einen relativ niedrigeren pI-Wert (6,84) und eine Nettoladung bei pH 7 (-0,2). Die Hydrophobie (40,37 %) von BLDef1 und HLDef1 war höher als die von BLDef2 und HLDef2 (35,34 %) (Tabelle 1). Die gesamten Struktureigenschaften von BLDef2 und HLDef2, wie pI-Wert, Nettoladung und Hydrophobie, waren bis auf die Anzahl der positiv geladenen Aminosäuren (18 bzw. 19) identisch. BLDef1 und HLDef1 wiesen unter den Propeptid-entfernten Defensinen ebenfalls die niedrigste Anzahl positiv geladener Aminosäuren (10) auf, zeigten jedoch den höchsten pI (9,61) und die höchste Nettoladung (6,8). Propeptid-entferntes BLDef2 und HLDef2 besaßen eine identische Anzahl positiv geladener Aminosäuren (11) und einen identischen Prozentsatz an Hydrophobie (38,24 %), wohingegen der pI (8,46 bzw. 8,29) und die Nettoladung (6,5 bzw. 5,5) unterschiedlich waren niedriger als die von Propeptid-entferntem BLDef1 und HLDef1. Native Defensine und Propeptid-entfernte Defensine aus Körper- und Kopfläusen zeigten ähnliche Molekulargewichte (12,1–12,9 bzw. 6,9–7,4 kDa).

Eine 3D-Strukturanalyse ergab, dass BLDef1 und HLDef1 beide aus einer einzigen, identischen α-Helix (His83–Lys93) bestanden, während BLDef2 und HLDef2 aus einer α-Helix (Asn87-Ile96) und zwei β-Faltblättern (β1: Gly104-Cys107) bestanden ; β2: Cys112-Arg115) (Abb. 3). Das reife Peptid von Defensin 2 enthielt eine andere Aminosäure in der Schleife zwischen den beiden antiparallelen β-Faltblättern, was zu einer leichten Verzerrung der Schleife führte, wie aus der Untersuchung des zusammengeführten Bildes hervorgeht (Abb. 3); Die Gesamtstrukturen von BLDef2 und HLDef2 waren jedoch nahezu identisch.

Dreidimensionale Proteinstrukturen von Laus-Defensin 1 (linkes Feld) und Defensin 2 (rechtes Feld) von Körper- (oben) und Kopfläusen (Mitte). Das untere Bild ist das zusammengeführte Bild. Dargestellt sind Seitenketten verschiedener Aminosäuren zwischen Körperlaus-Defensin 2 und Kopflaus-Defensin 2. N-ter, N-terminal; C-ter, C-Terminal

Sechs mutmaßliche Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen, darunter Bucklige (Hb)-artige, deformierte (Dfd)-artige, sogar übersprungene (Eve)-artige, schwanzlose (Tll)-artige, gepaarte (Prd)-artige und Mütter gegen dpp (Mad). )-ähnliche Stellen wurden häufig in den mutmaßlichen regulatorischen Regionen (800 bp stromaufwärts und 200 bp stromabwärts der Transkriptionsstartstelle) von BLDef1 und HLDef1 identifiziert, wobei eine zusätzliche Hb-ähnliche Bindungsstelle 796–802 bp stromaufwärts von HLDef1 vorhanden war (Abb. 4). Im Fall von Defensin 2 wurden sowohl in BLDef2 als auch in HLDef1 häufig fünf Transkriptionsfaktoren gefunden, darunter Hb-ähnliche, Dfd-ähnliche, Eve-ähnliche, Mad-ähnliche und e2-Faktor (E2F)-ähnliche Stellen, mit einer weiteren Hb-ähnliche Stelle liegt 88–94 bp stromaufwärts von HLDef2 (Abb. 4).

Potenzielle Transkriptionsfaktor-Bindungsmotive, die in der mutmaßlichen regulatorischen Region beobachtet werden (800 bp stromaufwärts und 200 bp stromabwärts von der Startstelle der Gentranskription). Balken mit unterschiedlichen Farben und Mustern stellen unterschiedliche mögliche Motive dar. Unterschiedliche Motive zwischen Körper und Kopflaus sind mit einem Sternchen gekennzeichnet. BLDef, Körperlaus-Defensin; HLDef, Kopflaus-Defensin; Dfd, deformiert; Eva, sogar übersprungen; Hb, Buckliger; Verrückt, Mütter gegen DPP; Prd, gepaart; T11, schwanzlos

Im 3'UTR des BLDef1-Transkripts wurden sechs mutmaßliche miRNA-Bindungsstellen vorhergesagt, während im HLDef1-Transkript drei mutmaßliche miRNA-Bindungsstellen vorhergesagt wurden (Tabelle 2). In der 3'UTR von Defensin-2-Transkripten wurden in BLDef2 fünf mutmaßliche miRNA-Bindungsstellen vorhergesagt, während in HLDef2 vier mutmaßliche miRNA-Bindungsstellen vorhergesagt wurden (Tabelle 2).

Die Positivkontrollen, darunter Ampicillin, Kanamycin und Gentamicin, hemmten das Wachstum von E. coli und S. aureus; Das Wachstum von C. albicans wurde jedoch selbst bei den höchsten Konzentrationen dieser Antibiotika (200 μM) und rekombinantem BLDef1 und BLDef2 (100 μM) nicht gehemmt (Tabelle 3). Ampicillin hemmte S. aureus mit 44,5-fach niedrigeren Werten der halbmaximalen Hemmkonzentration (IC50) (P = 0,0007) als gegen E. coli, während Kanamycin E. coli mit 8,5-fach niedrigeren IC50-Werten (P = 0,002) hemmte ) als solche gegen S. aureus, was darauf hinweist, dass diese beiden Antibiotika hochspezifische antimikrobielle Aktivitäten besitzen, die von der Bakterienart abhängen. Gentamicin zeigte niedrigere IC50-Werte gegen E. coli und S. aureus als die anderen beiden Antibiotika und rekombinanten Defensine der Körper- und Kopfläuse. Gereinigtes rekombinantes BL/HLdef1 und BLDef2 hemmten nur das Wachstum von S. aureus mit ähnlichen IC50-Werten (33,2 ± 1,4 μM bzw. 34,4 ± 0,8 μM; P = 0,2669), die etwa 20- bzw. 48-fach weniger wirksam waren als Ampicillin (P < 0,0001) bzw. Gentamicin (P < 0,0001), aber 1,8-fach wirksamer als Kanamycin (P = 0,0093 bzw. 0,0114). HLDef2 zeigte 6,1-, 6,4- und 11,4-fach niedrigere IC50-Werte gegen S. aureus als BL/HLDef1 (P = 0,004), BLDef2 (P = 0,0031) bzw. Kanamycin (P < 0,0001). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Laus-Defensine eine wirksamere antimikrobielle Aktivität gegen grampositive Bakterien besitzen als Kanamycin und dass HLDef2 eine signifikant höhere antimikrobielle Aktivität gegen grampositive S. aureus besitzt als BLDef2.

Die Behandlung mit 50 μM Gentamicin als Positivkontrolle führte zu einer 98,4-prozentigen Hemmung des B. quintana-Koloniewachstums im Vergleich zur mit Tris-HCl-Puffer behandelten Negativkontrolle (Abb. 5). Rekombinantes HLDef2 zeigte eine signifikant höhere antibakterielle Aktivität gegen B. quintana (97,2 %) (P < 0,0001) als BLDef2 (31,5 %) (P = 0,0023). Rekombinantes BL/HLDef1 zeigte keine offensichtliche antibakterielle Aktivität gegen B. quintana.

a Repräsentatives Bild von Gentamicin (P, Positivkontrolle), Tris-HCl-Puffer (N, Negativkontrolle) und BL/HLDef1-, BLDef2- oder HLDef2-behandelter Bartonella quintana-Mischung, getropft auf eine Schokoladenagarplatte. Gentamicin und Tris-HCl-Puffer wurden als Positiv- bzw. Negativkontrolle verwendet. b Ergebnis des Hemmtests der B. quintana-Mischung mit rekombinanten Laus-Defensinen. Der Kolonieindex wurde aus koloniebildenden Einheiten/Mikroliter (KBE/μl) dividiert durch KBE/μl der Negativkontrolle unter der Annahme ermittelt, dass B. quintana nicht durch Tris-HCl-Puffer gehemmt wird. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer Einweg-Varianzanalyse statistisch analysiert. Sternchen zeigen signifikante Unterschiede bei **P < 0,01 und ***P < 0,0001 an; ns, kein signifikanter Unterschied. BL/HLDef1, Körperlaus/Kopflaus-Defensin 1; BLDef2, Körperlaus-Defensin 2; HLDef2, Kopflaus-Defensin 2

Insektendefensine sind im Allgemeinen gegen ein breites Spektrum von Krankheitserregern wirksam [18]. Obwohl rekombinantes BL/HLDef1 nur gegen Gram-positives S. aureus aktiv war, zeigte rekombinantes BL/HLDef2 eine signifikant hohe antibakterielle Aktivität sowohl gegen Gram-positives S. aureus als auch gegen Gram-negatives B. quintana. Ähnliche Fälle, in denen Defensin Aktivität gegen gramnegative Bakterien zeigte, wurden zuvor bei verschiedenen Arthropoden berichtet [19,20,21,22,23,24]. Laus-Defensine zeigten jedoch trotz ihrer erheblich hohen antibakteriellen Aktivität keine offensichtliche hämolytische Aktivität, eine Beobachtung, die auch für andere Defensine berichtet wurde [17, 25].

Insekten-Defensine haben typischerweise eine N-terminale Schleife und eine α-Helix, gefolgt von einer antiparallelen β-Faltblattstruktur, die durch Disulfidbrücken verbunden ist [26]. BL/HLDef2 zeigte diese einzigartigen Strukturen; BL/HLDef1 schien jedoch nur ein α-helikales Fragment und drei Defensin-spezifische Cysteinpaare ohne β-Faltblatt zu haben. Darüber hinaus zeigten Laus-Defensine hohe pI-Werte, ähnlich wie andere Insekten-Defensine, die durch die Wechselwirkung zwischen positiv geladenen Peptiden und negativ geladenen bakteriellen Membrankomponenten (d. h. Polysaccharid und Lipopolysaccharid in grampositiven bzw. gramnegativen Bakterien) eine antibakterielle Wirkung entfalten [ 27].

Von den drei Domänen der Defensine (Signalpeptid, Propeptid und funktionelle reife Peptide) wird allgemein angenommen, dass das Propeptid durch seine entgegengesetzten Nettoladungen die antimikrobielle Aktivität der C-terminalen Domäne in humanen neutrophilen α-Defensinen (HNPs) hemmt [28]. . Die Aktivierung kationischer HNPs erfordert die proteolytische Entfernung des anionischen Propeptids [29], was darauf hindeutet, dass elektrostatische Kräfte für inhibitorische intermolekulare Wechselwirkungen zwischen dem kationischen reifen Peptid und dem anionischen Propeptid von Defensin entscheidend sein könnten [29]. Die Propeptide und reifen Peptide von BL/HLDef1 und BL/HLDef2 zeigten ebenfalls entgegengesetzte Nettoladungen: Die Nettoladung des kationischen reifen Peptids von BL/HLDef1 betrug 7,8 und die von BLDef2 und HLDef2 7,8 bzw. 6,8. Im Gegensatz dazu betrugen die Nettoladungen des anionischen Propeptids von BL/HLDef1 -8 und die von BL/HLDef2 -2 bzw. -1. Da diese Ergebnisse auf eine potenziell hemmende elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Propeptid und dem reifen Peptid von Laus-Defensinen hinweisen, haben wir nur die reifen Peptiddomänen von Laus-Defensinen ohne Propeptide exprimiert und ihre biologischen Eigenschaften untersucht.

Rekombinantes HLDef2 zeigte eine signifikant höhere antibakterielle Aktivität gegen gramnegatives B. quintana und grampositives S. aureus als rekombinantes BL/HLDef1 oder BLDef2. Da sich nur ein Aminosäurerest (Tyrosin für BLDef2 vs. Asparaginsäure für HLDef2) in der reifen Peptidregion von Defensin 2 zwischen Körper- und Kopfläusen unterscheidet, ist dieser Aminosäureunterschied wahrscheinlich für die unterschiedliche antibakterielle Aktivität gegen B. quintana und S. verantwortlich . aureus. Der einzige signifikant unterschiedliche Faktor, der durch den Aminosäureaustausch in den Struktureigenschaften zwischen BLDef2 und HLDef2 verursacht wurde, war die Nettoladung bei pH 7. Der Anstieg der Nettoladung (+ 6,5 für BLDef2 vs. + 5,5 für HLDef2) resultierte aus der Substitution von Asparaginsäure durch Tyrosin in BLDef2 und kann zur Verringerung der antibakteriellen Aktivität gegen gramnegative B. quintana und grampositive S. aureus beitragen, wie allgemein bei Insektendefensinen beobachtet wird, wo eine geringere Nettoladung mit hohen antimikrobiellen Aktivitäten gegen gramnegative Bakterien verbunden ist [ 30]. Darüber hinaus ist die β-Faltblatt-Subdomäne von Insekten-Defensinen, wie durch die Entwicklung des Nasonia vitripennis-Defensins als Modell gezeigt wurde, ein wichtiger Faktor für eine breite antibakterielle Aktivität gegen grampositive und gramnegative Bakterien. Daher ist es wahrscheinlich, dass die strukturelle Veränderung in der β-Faltblatt-Subdomäne, die durch die Substitution mit einem Tyrosinrest an der β-Schleife verursacht wird, die antibakterielle Aktivität von BLDef2 beeinflusst. Zusammengenommen scheinen die erhöhte Nettoladung und die strukturelle Veränderung in der β-Faltblatt-Subdomäne von BLDef2 die Hauptgründe für die verringerte antibakterielle Aktivität zu sein, insbesondere gegen B. quintana bei Körperläusen, was wiederum wahrscheinlich zu einer erhöhten Vektorkompetenz geführt hat.

Der einzige Unterschied in den Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen von Defensin 1 und 2 zwischen Körper- und Kopfläusen war das Vorhandensein einer zusätzlichen Hb-ähnlichen Proteinbindungsstelle in den regulatorischen Regionen von HLDef1 und HLDef2. Hunchback gehört zur Familie der C2H2-Zinkfingerproteine, die als genregulatorisches Protein fungieren [32]. Es ist unklar, ob Hb-ähnliche Proteine ​​die Transkription von Defensin-Genen im Körper und bei Kopfläusen aktivieren oder unterdrücken. Unter der Annahme der transkriptionsaktivierenden Rolle des Hb-ähnlichen Proteins bei Läusen kann das Vorhandensein einer zusätzlichen Bindungsstelle für Hb-ähnliches Protein in HLDef1 oder HLDef2 jedoch zu einem höheren Grundtranskriptionsniveau bei Kopfläusen führen [4] und in der induzierbare Expression von Defensin 1 im Gewebe des Verdauungstrakts von Kopfläusen nach oraler Belastung mit B. quintana [5]. miRNAs sind eine Klasse kurzer, endogener und nicht-kodierender RNAs mit einer Länge von 21–24 Nukleotiden, die die Genexpression über Basenpaarung mit mRNAs regulieren [33]. Die „Seed-Sequenz“ der miRNA mit zwei bis acht Nukleotiden am 5'-Ende bindet an die komplementäre Match-Stelle in der 3'-UTR von mRNAs, was zur Hemmung der Translation und Expression des Zielgens oder zum mRNA-Abbau führt [34]. Im 3'UTR des BLDef1-Transkripts wurde im Vergleich zum HLDef1-Transkript (3) eine erhöhte Anzahl mutmaßlicher miRNA-Bindungsstellen (6) vorhergesagt. Ebenso wurde im 3'UTR von BLDef2 im Vergleich zum HLDef2-Transkript (4) eine erhöhte Anzahl mutmaßlicher miRNA-Bindungsstellen (5) vorhergesagt. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Expression von BLDef1 und BLDef2 bei Kopfläusen eher herunterreguliert ist als die von HLDef1 und HLDef2. Daher scheint die relativ verringerte Expression von BLDef1 und BLDef2 in den Körperläusen zu einer verbesserten Vektorkompetenz beizutragen [5].

Das Verständnis des Immunsystems eines menschlichen krankheitsübertragenden Vektors ist von großer Bedeutung, da es das Immunsystem ist, das die Vektorkompetenz weitgehend bestimmt. Allerdings ist die Kaskade der Immunabwehr gegen bakterielle Krankheitserreger wie B. quintana, R. prowazekii und B. recurrentis bei Körperläusen noch weitgehend unbekannt. Dennoch haben wir aufgeklärt, (i) dass Körperläuse über ein funktionell verändertes Defensin 2 verfügen, das gegen B. quintana, einen in dieser Studie verwendeten Modellpathogen, deutlich weniger wirksam ist, und (ii) dass die Expression sowohl von Defensin 1 als auch von Defensin 2 erfolgt wahrscheinlich aufgrund der unterschiedlichen regulatorischen Sequenzen für die Transkriptionsfaktorbindung und die miRNA-Bindung herunterreguliert. Daher scheint die relativ höhere Vektorkompetenz von Körperläusen hauptsächlich auf die verringerte antibakterielle Aktivität von Defensin 2 gegen pathogene Bakterien und die geringeren Mengen an BLDef1 und BLDef2 zurückzuführen zu sein.

Defensin 1 und Defensin 2, die einzigen antimikrobiellen Peptide im menschlichen Körper und bei Kopfläusen, weisen Unterschiede in der Struktur und antimikrobiellen Aktivität auf. Die deutlich geringeren antibakteriellen Aktivitäten von Defensin 2 tragen zusammen mit der verringerten Wahrscheinlichkeit der Defensinexpression und Transkriptionsaktivitäten bei Körperläusen wahrscheinlich zu einer geschwächten Immunantwort auf die Proliferation und Lebensfähigkeit von B. quintana bei, was zu einer höheren Vektorkompetenz von Körperläusen im Vergleich zu Kopfläusen führt. Diese Daten werden ein tiefgreifendes Verständnis der durch die Defensine 1 und 2 vermittelten unterschiedlichen Vektorkompetenz zwischen Körper- und Kopfläusen ermöglichen.

Unzutreffend.

Antimikrobielles Peptid

Körperlaus-Defensin

Koloniebildende Einheit

Deformiert

E2-Faktor

Sogar übersprungen

Bucklige

Kopflaus Defensin

Halbmaximale Hemmkonzentration

Mütter gegen dpp

MicroRNA

Phosphatgepufferte Kochsalzlösung

Gepaart

rote Blutkörperchen

Schwanzlos

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Referenzen herunterladen

Wir möchten Prof. Jane Koehler (University of California, San Francisco) für den Stamm B. quintana JK31 und Prof. Jinki Yeom (Seoul National University College of Medicine) für seine aufschlussreichen Diskussionen danken.

Diese Arbeit wurde teilweise vom Seoul National University Hospital unterstützt. DEL wurde vom Brain Korea 21 Four-Programm unterstützt.

Forschungsinstitut für Landwirtschaft und Biowissenschaften, Seoul National University, Seoul, 08826, Republik Korea

Kyungjae Andrew Yoon & Si Hyeock Lee

Abteilung für Agrarbiotechnologie, Seoul National University, Seoul, 08826, Republik Korea

Eun Lee und Si Hyeock Lee

Abteilung für Tropenmedizin und Parasitologie, Seoul National University College of Medicine, Seoul, 03080, Republik Korea

Yoo Hyeon Kim

Institut für Endemische Krankheiten, Seoul National University College of Medicine, Seoul, 03080, Republik Korea

Yoo Hyeon Kim

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KAY führte Experimente durch und schrieb das Manuskript. DEL führte Experimente durch. SHL und JHK haben die Studie entworfen. JHK betreute die Forschungsarbeit und verfasste das Manuskript. Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Ju Hyeon Kim.

Das In-vitro-Aufzuchtsystem von Körper- und Kopfläusen unter Verwendung von menschlichem Blut und der hämolytische Test von Defensinen aus Körper- und Kopfläusen wurden vom Institutional Review Board der Seoul National University, IRB Nr. E2211/001–003, überprüft und genehmigt.

Unzutreffend.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Springer Nature bleibt neutral hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten.

Primer zur In-vitro-Expression von Defensin 1 und 2 von Körper- und Kopfläusen.

Hämolytische Aktivitäten rekombinanter Defensine aus Körper- und Kopfläusen und Antibiotika.

Aminosäuresequenz-Alignments von Defensin 1 und 2 aus Körper- und Kopfläusen und anderen Insektenarten. Sechs konservierte Cysteinreste sind durch rote Kästchen markiert.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. Der Creative Commons Public Domain Dedication-Verzicht (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) gilt für die in diesem Artikel zur Verfügung gestellten Daten, sofern in einer Quellenangabe für die Daten nichts anderes angegeben ist.

Nachdrucke und Genehmigungen

Yoon, KA, Lee, D., Lee, S. et al. Untersuchung der möglichen Rolle von Defensinen bei der unterschiedlichen Vektorkompetenz von Körper- und Kopfläusen für Bartonella quintana. Parasites Vectors 16, 183 (2023). https://doi.org/10.1186/s13071-023-05802-4

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Eingegangen: 21. Februar 2023

Angenommen: 08. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s13071-023-05802-4

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