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May 13, 2023

C11orf54 fördert die DNA-Reparatur durch Blockierung von CMA

Band Kommunikationsbiologie

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 606 (2023) Diesen Artikel zitieren

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C11orf54 ist eine Esterhydrolase, die in verschiedenen Spezies hochkonserviert ist. C11orf54 wurde als Biomarkerprotein für Nierenkrebs identifiziert, seine genaue Funktion ist jedoch noch wenig verstanden. Hier zeigen wir, dass der Abbau von C11orf54 die Zellproliferation verringert und die Cisplatin-induzierte DNA-Schädigung und Apoptose verstärkt. Einerseits verringert der Verlust von C11orf54 die Rad51-Expression und die Zellkernakkumulation, was zu einer Unterdrückung der homologen Rekombinationsreparatur führt. Andererseits interagieren C11orf54 und HIF1A kompetitiv mit HSC70. Der Abbau von C11orf54 fördert die Bindung von HSC70 an HIF1A, um dessen Abbau durch Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA) zu fördern. Der durch C11orf54-Knockdown vermittelte HIF1A-Abbau verringert die Transkription der regulatorischen Untereinheit M2 (RRM2) der Ribonukleotidreduktase, die ein geschwindigkeitsbestimmendes RNR-Enzym für die DNA-Synthese und DNA-Reparatur durch die Produktion von dNTPs ist. Die Ergänzung von dNTPs kann durch C11orf54-Knockdown verursachte DNA-Schäden und Zelltod teilweise retten. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Bafilomycin A1, ein Inhibitor sowohl der Makroautophagie als auch der Chaperon-vermittelten Autophagie, ähnliche Rettungseffekte zeigt wie die dNTP-Behandlung. Zusammenfassend entdecken wir eine Rolle von C11orf54 bei der Regulierung von DNA-Schäden und -Reparatur durch CMA-vermittelte Verringerung der HIF1A/RRM2-Achse.

Die genomische Integrität ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase, die normale Entwicklung und die Krebsprävention1. Sowohl endogener als auch exogener genomischer Stress verursacht DNA-Einzelstrangbrüche (SSBs) und DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs), was zu einer aktiven DNA-Schadensreaktion (DDR)2,3 führt. DDR-Signalwege erkennen, signalisieren und reparieren verschiedene Arten von DNA-Schäden, was für die Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität von entscheidender Bedeutung ist4. Die homologe Rekombination (HR) stellt den Hauptmechanismus für die fehlerfreie homologiegesteuerte Reparatur von DSBs und Interstrand-Crosslinks (ICLs) dar. Das Rad51 und seine Paralogs spielen in diesem Prozess eine wesentliche Rolle5,6. Ribonukleotidreduktase (RNR) katalysiert Desoxyribonukleotide (dNTP), die für die DNA-Synthese benötigt werden. Die beiden Untereinheiten RRM1 (Ribonukleotidreduktase Catalytic Subunit M1) und RRM2 (Ribonukleotidreduktase Regulatory Subunit M2) bilden den α2β2-Komplex zur Ausübung der katalytischen Aktivität, und das Gleichgewicht der dNTPs innerhalb der Zellen ist für die zelluläre Homöostase und die Aufrechterhaltung der genomischen Integrität von entscheidender Bedeutung7,8,9. Das geschwindigkeitsbestimmende RNR-Enzym RRM2 ist für die DNA-Synthese und DNA-Reparatur durch die Produktion von dNTPs10 essentiell.

Der Hypoxie-induzierbare Faktor 1 (HIF1) ist ein dimerer Transkriptionskomplex, der an vielen biologischen Prozessen wie Stoffwechsel, Entzündung und Tumorentstehung beteiligt ist11. HIF1A ist eine Untereinheit des HIF1-Komplexes, die durch HIF-spezifische Prolylhydroxylasen (PHDs) in Gegenwart von O2 modifiziert wurde. Modifiziertes HIF1A wird durch das Proteasom abgebaut, was eine sauerstoffabhängige Prolinhydroxylierung und von Hippel-Lindau (VHL)-vermittelte Ubiquitinierung erfordert12. Darüber hinaus wurde berichtet, dass HIF1A DDR auf verschiedene Weise reguliert. P-H2A.X ist ein Marker für DNA-Doppelstrangbrüche, um das Schadenssignal zu verstärken und DNA-Schadensreparaturproteine ​​zu rekrutieren13. In Krebszellen verringert der Abbau von HIF1A die durch Hypoxie verursachte p-H2A.X-Akkumulation und beeinflusst dann die Fähigkeit zur Reparatur von DNA-Schäden und die Resistenz gegen Tumortherapien14. Die durch Hypoxie vermittelte Stabilisierung von HIF1A fördert die Transkription von hTERT (Telomerase-Reverse-Transkriptase) und hTR (Telomerase-RNA-Komponente) und reguliert dann DNA-Schäden und genomische Stabilität15,16. Unterdessen könnte der Verlust von HIF1A die Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen einschränken und empfindlicher auf Chemotherapie reagieren17,18.

Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA) ist eine Form der Autophagie, bei der Substrate direkt zum Lysosom gelenkt werden, um dort abgebaut zu werden. CMA-Substratproteine ​​werden selektiv vom Hitzeschock-verwandten Protein von 70 kDa (HSC70) erkannt und auf Lysosomen gezielt, um anschließend zum CMA-vermittelten Abbau an den lysosomalen Membranrezeptor Typ 2A (LAMP2A) rekrutiert zu werden19. CMA ist an der DNA-Reparatur beteiligt und kann eine maligne Transformation verhindern, indem es die Genomstabilität aufrechterhält19. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass HIF1A ein CMA-Substrat ist und an der Regulierung des Zellzyklus beteiligt ist. HIF1A wird CMA-abhängig abgebaut, wenn es auf Lys63 durch die E3-Ubiquitin-Protein-Ligase STUB120 ubiquityliert wird. Checkpoint-Kinase 1 (CHK1), der Zellzyklusregulator, ist ein weiteres CMA-Substrat. Die CMA-Hemmung führt dazu, dass Chk1 während der Reaktion auf DNA-Schäden im Zellkern verbleibt, was zur Anhäufung von DNA-Schäden führt und die DNA-Reparatur beeinträchtigt21.

C11orf54 (offener Leserahmen 54 von Chromosom 11), auch bekannt als PTD012, ist ein hochkonserviertes Gen, das in Mus musculus, Brachydanio rerio, Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans exprimiert wird22. Menschliches C11orf54 enthält ein Zn2+-Ion, das an drei Histidinreste koordiniert ist, und zeigt Esterhydrolaseaktivität22. Darüber hinaus spielt das Drosophila melanogaster-Ortholog von C11orf54 eine entscheidende Rolle bei der Proteinhomöostase während Überernährung23. C11orf54 wurde durch zweidimensionale Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie als Biomarkerprotein für Endometriumkrebs, Nierenzellkarzinom und klarzelliges Nierenzellkarzinom identifiziert24,25,26. Allerdings ist seine Funktion bei Säugetieren noch unklar.

In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass C11orf54 die Zellproliferation und Apoptose reguliert. Der Abbau von C11orf54 aktivierte die ATM-abhängige DNA-Schadensantwort (DDR) und inhibierte die Reparatur der homologen Rekombination durch Unterdrückung der Expression von Rad51. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass C11orf54 kompetitiv mit HSC70 interagierte, was die Interaktion zwischen HIF1A und HSC70 unterbrach. Somit verstärkte der Abbau von C11orf54 die Bindung von HSC70 an HIF1A, was zum Abbau von HIF1A über Chaperon-vermittelte Autophagie führte. Darüber hinaus könnte die Blockierung von CMA durch Bafilomycin A1 (BafA1) den durch C11orf54-Knockdown verursachten DNA-Schaden und die Unterdrückung der Zellproliferation teilweise wiederherstellen. Unsere Daten zeigten, dass C11orf54 die DNA-Reparatur fördert, indem es den CMA-vermittelten Abbau von HIF1A blockiert.

Die Kristallstruktur von C11orf54 zeigte, dass es sich um eine Esterhydrolase handelt, die zur Superfamilie der Metallo-β-Lactamase-Faltproteine ​​gehören könnte22. C11orf54 ist unter Arten wie Homo sapiens, Mus musculus, Brachydanio rerio, Drosophila melanogaster und Caenorhabditis elegans konserviert. C11orf54 exprimiert universell in verschiedenen Geweben menschlicher Spezies, insbesondere angereichert in Nieren- und Lebergewebe (ergänzende Abbildung 1). Daher verwendeten wir 293T und Hepatozyten, um die physiologische Funktion von C11orf54 zu untersuchen.

Eine frühere Studie hat mithilfe eines automatischen Phänotypisierungsansatzes gezeigt, dass C11orf54 vorwiegend im Kern lokalisiert ist. In einer anderen Studie wurde C11orf54 im Zytoplasma und Zellkern von C11orf54-überexprimierten Zellen nachgewiesen28. Um die genaue subzelluläre Lokalisierung von endogenem C11orf54 zu untersuchen, führten wir den Kern-/Zytosolfraktionierungstest und das Immunfärbungsexperiment unter Verwendung der verifizierten Antikörper durch. Zuerst erzeugten wir C11orf54-Knockdown-Zellen mithilfe von zwei verschiedenen shRNAs (shC11orf54-1, shC11orf54-2)-vermittelter Gen-Stummschaltung. Die Protein- und mRNA-Spiegel von C11orf54 waren in C11orf54-Knockdown-Zellen signifikant reduziert (Abb. 1a, b). Anschließend haben wir C11orf54 in den Knockdown-Zellen überexprimiert, um die Spezifität der C11orf54-Antikörper zu überprüfen (Abb. 1c). Das Fehlen von Blots deutete auf eine erfolgreiche Konstruktion der C11orf54-Knockdown-Zelllinie hin und bestätigte auch die Spezifität des C11orf54-Antikörpers. Die Immunfärbungsexperimente zeigten, dass endogenes C11orf54 überwiegend im Zytoplasma lokalisiert war (Abb. 1d, e). Darüber hinaus zeigte der Kern-/Zytosol-Fraktionierungstest übereinstimmende Ergebnisse, dass C11orf54 hauptsächlich bei der Zytoplasma-Fraktionierung beobachtet wurde (Abb. 1f, g). Insgesamt legen diese Daten nahe, dass C11orf54 vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert ist.

a, b Western Blot (a) und qPCR (b) Experimente zeigen die Knockdown-Effizienz von C11orf54 (shC11orf54-1, shC11orf54-2) in der PLC/PRF/5-Zelllinie. ACTB wurde als Kontrolle verwendet (n = 3 biologische Replikate, Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, ***p < 0,001). c Western Blot zeigt die Spezifität des C11orf54-Antikörpers in den C11orf54-Knockdown-Zellen und die Wiedereinführung von C11orf54 in die C11orf54-Knockdown-Zellen. d Repräsentative Immunfärbungsbilder bestätigen die subzelluläre Lokalisierung von C11orf54 in Wildtyp-Zellen. Maßstabsbalken = 20 μm. e Repräsentative Immunfärbungsbilder bestätigen die subzelluläre Lokalisierung von C11orf54 in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen. Maßstabsbalken = 10 μm. f, g Der Kern-/Zytosol-Fraktionierungstest zeigt die subzelluläre Lokalisierung von C11orf54 in der PLC/PRF/5-Zelllinie mit zwei verifizierten Antikörpern von Proteintech (f) und Invitrogen (g). GAPDH wurde als Zytoplasma-Marker (Cyto) und H3 als Marker des Zellkerns (Nuc) verwendet.

Als nächstes untersuchten wir, ob der Abbau von C11orf54 die Zellproliferation und Apoptose beeinflusst, die wichtige zelluläre Ereignisse bei der Entwicklung von Organismen sind29. Der CCK8-Assay zeigte, dass die C11orf54-Stummschaltung das Wachstum von PLC/PRF/5- und 293T-Zellen (Abb. 2a; ergänzende Abb. 2a) und die Koloniebildung (Abb. 2b, c und ergänzende Abb. 2b, c) signifikant hemmte. Darüber hinaus konnten wir in der C11orf54-Knockdown-Zelle im Vergleich zur Kontrollzelle eine deutlich verringerte Anzahl EdU-positiver Zellen feststellen (Abb. 2d, e). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ein C11orf54-Mangel die Zellproliferation unterdrückt.

Ein CCK8-Assay zeigt das Zellüberleben von Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen (Daten werden als Mittelwerte ± SD, ***p < 0,001 dargestellt). b, c Koloniebildung (b) und quantitative Ergebnisse (c) zeigen das Zellwachstum von Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen (n = 3 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, *p < 0,05, **p < 0,01). d, e EdU-Färbung bestätigt die Wirkung des C11orf54-Knockdowns auf die Zellproliferation in der PLC/PRF/5-Zelllinie. Die Bilder zeigen eine EdU-Färbung (rote Farbe) in Kombination mit einer DAPI-Färbung (blaue Farbe). (Maßstabsbalken = 100 μm; Daten werden als Mittelwerte ± SD, ***p < 0,001 dargestellt). f, g Western Blots (f) und quantitative Ergebnisse (g) der C11orf54-Expression in PLC/PRF/5-Zellen, behandelt mit 10 μM Cisplatin für verschiedene Zeiten (0 h, 1 h, 6 h, 12 h und 24 h) (n = 3 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, ***p < 0,001). h Lebensfähigkeitstest nach Inkubation mit Cisplatin in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen in verschiedenen Konzentrationen (5 μM, 20 μM, 40 μM und 100 μM). i, j Koloniebildungsanalyse des C11orf54-Knockdowns auf die Cisplatin-Empfindlichkeit nach Behandlung mit 3 μM Cisplatin für 24 Stunden und Kultivierung in einem wirkstofffreien Medium für weitere 10 Tage (n = 3 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, * **p < 0,001). k, l Analyse der Apoptose durch Annexin V(FITC)/Propidiumiodid (PI)-Doppelfärbung (L) und quantitative Ergebnisse (K) in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-Zellen nach 48-stündiger Behandlung mit 10 μM Cisplatin (n = 4 biologische Replikate). ; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, ***p < 0,001). m, n Western Blots (m) und quantitative Ergebnisse (n) der angegebenen Proteine ​​in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen nach 48-stündiger Behandlung mit 10 μM Cisplatin (n = 3 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwert dargestellt). Werte ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

Interessanterweise stellten wir fest, dass die Expression von C11orf54 bei der Behandlung mit Cisplatin (CDDP) zeitabhängig zunahm (Abb. 2f, g). Um zu untersuchen, ob andere genotoxische Induktoren die Expression von C11orf54 regulieren können, haben wir die C11orf54-Expression bei Behandlung mit Hydroxyharnstoff (HU) und Camptothecin (CPT) untersucht. In ähnlicher Weise könnten HU und CPT auch die Expression von C11orf54 zeitabhängig fördern (ergänzende Abbildung 3a – d). Diese Daten zeigten, dass C11orf54 auf die genotoxischen Induktoren reagieren könnte, was darauf hindeutet, dass C11orf54 möglicherweise eine Rolle beim durch genotoxische Medikamente verursachten Zelltod spielt. Tatsächlich zeigten die Zelllebensfähigkeits- und Koloniebildungstests, dass C11orf54-Knockdown-Zellen empfindlicher auf Cisplatin reagierten als Kontrollzellen (Abb. 2h – j). Die Doppelfärbung mit Annexin V (FITC)/Propidiumiodid (PI) zeigte, dass die Cisplatin-induzierte Apoptose in der frühen und späten Phase in den C11orf54-Knockdown-Zellen erhöht war (Abb. 2k, l). Der TUNEL-Assay zeigte auch, dass der Verlust von C11orf54 die Apoptose unter Cisplatin-Behandlung förderte (ergänzende Abbildung 3e, f). Darüber hinaus fanden wir heraus, dass der Abbau von C11orf54 die Spaltung von Caspase 3 und PARP1 verstärkt, die eine zentrale Rolle bei der Apoptoseausführung spielen (Abb. 2m, n). Interessanterweise schien die Wirkung von C11orf54 auf die Caspase3-Aktivierung nur in Gegenwart von Cisplatin zu wirken, was möglicherweise darauf zurückzuführen ist, dass Cisplatin die Apoptoseneigung nach dem Abbau von C11orf54 verstärkt. Unterdessen wurden in den C11orf54-Knockdown-Zellen ein erhöhter pro-apoptotischer BAX und ein verringerter anti-apoptotischer Bcl-2 beobachtet (Abb. 2m, n). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass ein C11orf54-Mangel die Zellproliferation unterdrückt und die Apoptose fördert.

Genotoxische Medikamente führen zum Zelltod, indem sie die DNA-Synthese hemmen oder die DNA-Struktur zerstören. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Proteingehalt von C11orf54 nach der Behandlung mit genotoxischen Arzneimitteln erhöht war (Abb. 2f, g und ergänzende Abb. 3a – d), was darauf hindeutet, dass C11orf54 möglicherweise an der Genomstabilität oder DNA-Schädigung beteiligt ist. Um zu untersuchen, ob C11orf54 an medikamenteninduzierten DNA-Schäden beteiligt ist, verwendeten wir einen Comet-Assay zum Nachweis von Doppelstrangbrüchen (DSBs) nach der Behandlung mit Cisplatin. Die durch die Tail-DNA und das Tail-Moment angezeigten DNA-Fragmente waren in C11orf54-Knockdown-Zellen nach der Cisplatin-Behandlung dramatisch erhöht (Abb. 3a – c). Zusätzlich untersuchten wir den γH2A.X (p-H2A.X-Ser139)-Spiegel, der als Marker für DNA-Schäden30 erkannt wird, mittels Immunfluoreszenzfärbung und Western-Blot-Assay. Die C11orf54-Stummschaltung erhöhte die Anzahl der γH2A.X-Foci (Abb. 3d, e) und den Proteingehalt (Abb. 3f, g) sowohl unter Cisplatin- als auch unter normalen Bedingungen im Vergleich zu den Kontrollzellen signifikant. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Abbau von C11orf54 die DNA-Schädigung fördert.

a–c Repräsentative Bilder des Comet-Assays in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen (a) und der Quantifizierung von Schwanz-DNA % (b) und Schwanzmoment (c) (n = 20 unabhängige Zellen; Daten werden als Mittelwert dargestellt). Werte ± SD; ***p < 0,001). Maßstabsbalken = 30 μm. d, e Repräsentative Bilder von γH2A.X-Foci (d) und quantitative Ergebnisse (e) in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen (n = 10 unabhängige Zellen; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt; *p < 0,05 , ***p < 0,001). Maßstabsbalken = 10 μm. f, g Western Blots (f) und quantitative Ergebnisse (g) der angegebenen Proteine ​​in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen nach 10 μM Cisplatin-Behandlung für 6 Stunden (n = 3 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte dargestellt ± SD; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). h, i Western Blots (h) und quantitative Ergebnisse (i) der angegebenen Proteine ​​in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen auf 10 μM Cisplatin und 10 μM Cisplatin plus 10 μM KU-60019 für 6 Stunden (n = 3). biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001).

ATM (Ataxia-telangiectasia mutated) ist eine der am weitesten vorgelagerten Kinasen im DDR-Signalweg, deren Aktivierung die Phosphorylierung einer Reihe von Kinasen wie Chk1 und Chk231,32,33,34 auslösen kann. Wir fanden heraus, dass der Abbau von C11orf54 die Phosphorylierung von ATM und seinem nachgeschalteten Chk1/Chk2 unter normalen Bedingungen und unter Cisplatin-Behandlung fördert (Abb. 3f, g). Das gleiche Phänomen konnten wir auch bei 293T-Zellen beobachten (ergänzende Abbildung 2d). Darüber hinaus könnte der ATM-Kinase-Inhibitor KU-60019 die erhöhte Expression von p-ATM, p-CHK1, p-CHK2 und p-H2A.X in C11orf54-Knockdown-Zellen sowohl unter Kontroll- als auch unter Cisplatin-Behandlungsbedingungen teilweise unterdrücken (Abb. 3h, i). . Diese Daten legen nahe, dass der Abbau von C11orf54 DNA-Schäden auf einem ATM-abhängigen Weg aktiviert.

Die DNA-Reparatur ist ein evolutionär konservierter Weg, der DNA-Schäden aus endogenen oder exogenen Quellen reparieren kann, um die genomische Integrität aufrechtzuerhalten35,36. Wir haben uns gefragt, ob C11orf54 den DNA-Reparaturmangel reguliert. Zunächst haben wir die Expression von Rad51 und Ku70 nachgewiesen, zwei kritischen Proteinen bei der homologen Rekombination (HR) bzw. der nicht homologen Endverbindung (NHEJ). Wir fanden heraus, dass der Abbau von C11orf54 die Expression von Rad51, jedoch nicht von Ku70, signifikant unterdrückte (Abb. 4a, b), und Immunfärbungsexperimente zeigten, dass der Verlust von C11orf54 die Bildung von Rad51-Herden im Zellkern hemmte (Abb. 4c, d), was darauf hindeutet, dass C11orf54 möglicherweise vorhanden ist an der homologen Rekombination beteiligt. Daher haben wir die homologe Rekombinationsreparaturaktivität in C11orf54-Knockdown- und Kontrollzellen mithilfe des HR-Reportersystems bewertet. In diesem System wird GFP durch die I-SceI-Stelle unterbrochen und das funktionsfähige GFP kann durch HR-Reparatur unter Verwendung des nachgeschalteten GFP als Matrize nach der I-SceI-Expression wiederhergestellt werden37. Wir haben pDR-GFP und pCBA-SceI in C11orf54-Knockdown- und Kontrollzellen co-transfiziert und dann die GFP-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie erfasst. Wir fanden heraus, dass der Prozentsatz an GFP-positiven Zellen in C11orf54-Knockdown-Zellen signifikant verringert war (Abb. 4e, f), was darauf hindeutet, dass der Knockdown von C11orf54 die HR-Reparaturaktivität unterdrückte. Darüber hinaus zeigten C11orf54-Knockdown-Zellen im Vergleich zu den Kontrollzellen nach Absetzen der Cisplatin-Behandlung eine langsamere Clearance von p-H2A.X-Herden (Abb. 4g, h). Insgesamt legen diese Daten nahe, dass der Abbau von C11orf54 die homologe Rekombinationsreparatur beeinträchtigt, was den DNA-Schaden verstärkt.

a, b Western Blots (a) und quantitative Ergebnisse (b) der angegebenen Proteine ​​in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen nach 6-stündiger Behandlung mit 10 μM Cisplatin (n = 3 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte dargestellt). ± SD; ***p < 0,001). c, d Repräsentative Bilder von Rad51-Herden (d) und quantitative Ergebnisse (c) in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-Zellen zum angegebenen Zeitpunkt nach der Cisplatin-Behandlung (n = 10 unabhängige Zellen; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt; ** p < 0,01). Maßstabsbalken = 10 μm. e, f Durchflusszytometrische Analyse (e) und quantitative Ergebnisse (f) der GFP-positiven Zellen in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen nach co-transfiziertem pDR-GFP und pCBA-SceI (n = 3 biologische Replikate; ***p < 0,001). g, h Repräsentative Bilder von p-H2A.X-Herden (g) und quantitative Ergebnisse (h) in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen zum angegebenen Zeitpunkt nach der Cisplatin-Behandlung (n = 10 unabhängige Zellen; Daten sind dargestellt als Mittelwerte ± SD; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). Maßstabsbalken = 10 μm.

Um den möglichen Mechanismus der durch C11orf54-Knockdown vermittelten Beeinträchtigung der homologen Rekombinationsreparatur zu identifizieren, analysierten wir die Transkriptome in C11orf54-Knockdown- und Kontrollzellen durch Hochdurchsatz-RNA-Sequenzierung (RNA-Seq). Wir identifizierten 708 signifikante, unterschiedlich exprimierte Gene (303 hochregulierte Gene und 405 herunterregulierte Gene) in C11orf54-Knockdown-Zellen, die durch das Vulkandiagramm visualisiert wurden (Abb. 5a). Darüber hinaus führten wir Funktionsanalysen von DEGs (Differentially Expressed Genes) mithilfe der KEGG-Datenbank durch. Die 20 wichtigsten herunterregulierten KEGG-Signalwege sind in Abb. 5b aufgeführt. Glykolyse/Glukoneogenese und HIF1-Signalweg wurden in C11orf54-Knockdown-Zellen herunterreguliert (Abb. 5b). Die GSEA-Ergebnisse zeigten übereinstimmend, dass die Gensätze im Zusammenhang mit Hypoxie (NES = −1,4, p-Wert = 0,005) und Glykolyse-Glukoneogenese (NES = −1,5, p-Wert = 0,011) in der pLKO.1-Gruppe angereichert waren (Abb. 5c). HIF1A ist ein bekannter Transkriptionsfaktor, der die Transkription von Glykolyse- und glykolytischen Genen reguliert38. Daher untersuchten wir die Expression von HIF1-Zielgenen und Glykolyse/Glukoneogenese-assoziierten Genen in den C11orf54-Knockdown-Zellen. Die qPCR-Ergebnisse zeigten, dass die meisten Glykolyse-assoziierten Gene (GLUT1, GLUT2, PGK1, ENO1, PDK3, LDHA und PDHA1) sowie die Gluconeogenese-assoziierten Gene (FBP1 und PEPCK) in C11orf54-Knockdown-Zellen signifikant verringert waren (Abb. 5d). Darüber hinaus wurde durch den Abbau von C11orf54 der Proteingehalt von PKM2, HK2, LDHA, PFKP und HIF1A deutlich gesenkt (Abb. 5e, f). Diese Daten deuten darauf hin, dass der Abbau von C11orf54 den HIF1A-Signalweg unterdrückt.

ein Vulkandiagramm, das die signifikant veränderten Gene im C11orf54-Knockdown im Vergleich zur Kontrollprobe zeigt (roter Punkt: hochregulierte Gene, blauer Punkt: herunterregulierte Gene, grauer Punkt: keine signifikant veränderten Gene). b Die 20 wichtigsten funktionell angereicherten KEGG-Pfade, die bei der Analyse von DEGs im C11orf54-Knockdown im Vergleich zur Kontrollprobe gefunden wurden. c Die Gen-Set-Anreicherungsanalyse (GSEA) zeigt, dass der Hypoxie- und Glykolyse-Glukoneogenese-Signalweg tendenziell die C11orf54-Knockdown-Gruppe anreichert. d qPCR-Experimentanalyse der mRNA-Expression der Glykolysegene in C11orf54-Knockdown- und Kontrollzellen (n = 4 biologische Replikate, Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001). e, f Western Blots (e) und quantitative Ergebnisse (f) der Glykolyseproteine ​​in C11orf54-Knockdown- und Kontrollzellen (n = 4 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01 dargestellt ).

Als nächstes fragten wir uns, welches Downstream-Ziel von HIF1A an der DNA-Reparatur in C11orf54-Knockdown-Zellen beteiligt war. Obwohl die Wechselwirkung zwischen Glykolyse und DNA-Reparaturwegen weiterhin unklar ist, deuten mehrere Studien darauf hin, dass die Glykolyse die Stabilität des Genoms aufrechterhalten kann, indem sie essentielle Metaboliten für den DNA-Metabolismus bereitstellt39. Beispielsweise wandelt der Pentosephosphatweg (PPP) das Glykolyse-Zwischenprodukt (Glucose-6-phosphat) in Ribose-5-phosphat für die Synthese von Nukleotiden und NADPH um, um DNA-Schäden zu reduzieren40,41. Daher bewerteten wir das NADPH/NADP+-Verhältnis (ein bekannter Biomarker von PPP) und die Expression von Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase (dem geschwindigkeitsbestimmenden Enzym von PPP) in der C11orf54-Knockdown- und Kontrollzelle. Es gibt jedoch keinen Unterschied im NADPH/NADP+-Verhältnis und der G6PD-Expression zwischen C11orf54-Knockdown- und Kontrollzellen (ergänzende Abbildung 4a, b), was darauf hindeutet, dass der Abbau von C11orf54-vermittelten DNA-Schäden möglicherweise nicht über den Glykolyseweg erfolgt.

Um weiter zu untersuchen, wie C11orf54 die Reparatur von DNA-Schäden reguliert, haben wir die mRNA-Spiegel von Genen gemessen, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind. Wie in Abb. 6a gezeigt, blieben die meisten Transkriptniveaus der Kandidatengene mit Ausnahme von RRM2 unverändert. Darüber hinaus war der Proteingehalt von RRM2 in C11orf54-Knockdown-Zellen sowohl unter Cisplatin- als auch unter Kontrollbedingungen signifikant verringert (Abb. 6b, c). RRM2, die kleine Untereinheit der Ribonukleotidreduktase, ist für die DNA-Synthese und -Reparatur durch die Produktion von dNTPs42 essentiell. Es wurde berichtet, dass der HIF-1α/STAT3-Signalweg das RRM2-Transkriptionsniveau hochregulieren könnte43,44. Daher haben wir festgestellt, ob die Ergänzung von Nukleosiden den durch C11orf54-Knockdown verursachten DNA-Schaden beheben kann. Die Ergänzung mit Nukleosiden reduzierte teilweise die γ-H2AX-Foci in den C11orf54-Knockdown-Zellen (Abb. 6d, e). Darüber hinaus wurde die unterdrückte Koloniebildung in C11orf54-Knockdown-Zellen auch teilweise durch Nukleosid-Supplementierung wiederhergestellt (Abb. 6f, g). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Abbau von C11orf54 durch die Unterdrückung der HIF1A/RRM2-Achse eine DNA-Schädigung verursacht.

eine qPCR-Analyse der mRNA-Expression von HIF1A-Downstream-DNA-Reparaturzielgenen in C11orf54-Knockdown- und Kontrollzellen (n = 4 biologische Replikate, Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, ***p < 0,001). b, c Western Blots (b) und quantitative Ergebnisse (c) der angegebenen Proteine ​​in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-Zellen nach 6-stündiger Behandlung mit 10 μM Cisplatin (n = 4 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, ** *p < 0,001). d, e Repräsentative Bilder von γH2A.X-Foci (d) und quantitative Ergebnisse (e) in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit 100 μM dNTP. (n = 10 unabhängige Zellen; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt; **p < 0,01, ***p < 0,001). Maßstabsbalken = 10 μm. f, g Koloniebildung (f) und quantitative Ergebnisse (g) zeigen das Zellwachstum von C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen und Kontrollzellen unter 100 μM dNTP-Behandlung für 24 Stunden (n = 3 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwert dargestellt). Werte ± SD, *p < 0,05, **p < 0,01).

Als nächstes untersuchten wir, wie C11orf54 die HIF1A-Expression reguliert. Da der Abbau von C11orf54 den mRNA-Spiegel von HIF1 nicht beeinflusst (Abb. 6a), haben wir den Abbau von HIF1A bewertet. Zuerst behandelten wir die Zelle mit dem PHD-Inhibitor CoCl2, was zu einer Stabilisierung und Akkumulation von HIF1A führte. Der Abbau von C11orf54 verringerte jedoch durchgängig die HIF1A-Expression bei der Behandlung mit CoCl2 (ergänzende Abbildung 5a), was darauf hindeutet, dass der Abbau von C11orf54-unterdrücktem HIF1A möglicherweise nicht über die Regulierung der HIF1A-Stabilisierung erfolgt. Dann fragten wir uns, ob der Abbau von C11orf54 unter Verwendung von MG132 und BafA1 einen HIF1A-Abbau über den Proteasom- oder Autophagie-Lysosom-Weg verursacht. Wir fanden heraus, dass die HIF1A-Expression nach der BafA1-Behandlung wiederhergestellt wurde, nicht jedoch die MG132-Expression (Abb. 7a, b). BafA1 ist ein weit verbreiteter Inhibitor für die Autophagosom-Lysosom-Fusion und die Autolysosom-Ansäuerung, was darauf hindeutet, dass C11orf54 den HIF1A-Abbau auf autophagieabhängige Weise fördern könnte.

a, b Western Blots (a) und quantitative Ergebnisse (b) der angegebenen Proteine ​​in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-Zellen nach 8-stündiger Behandlung mit 10 μM MG132 und 100 nM BafA1 (n = 4 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± dargestellt SD, ***p < 0,001). c, d Western Blots (c) und quantitative Ergebnisse (d) der angegebenen Proteine ​​in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-Zellen nach HBSS- und 1 μM Rapamycin-Behandlung für 12 Stunden (n = 4 biologische Replikate; Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt, ***p < 0,001). e, f Repräsentative Bilder (e) und quantitative Ergebnisse (f) von GFP-LC3-Punkten in Kontroll- und C11orf54-Knockdown-Zellen nach 48-stündiger Transfektion unter normaler und 100 nM BafA1-Behandlung für 8 Stunden. (Maßstabsbalken = 20 μm; Daten werden als Mittelwerte ± SD, *p < 0,05, ***p < 0,001 dargestellt). Der g-CCK8-Assay zeigt das Zellüberleben von C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen und Kontrollzellen bei normaler und 0,5 nM BafA1-Vorbehandlung für 12 Stunden (Daten werden als Mittelwerte ± SD, ***p < 0,001 dargestellt). h, i Koloniebildung (h) und quantitative Ergebnisse (i) zeigen das Zellwachstum von C11orf54-Knockdown-PLC/PRF/5-Zellen und Kontrollzellen nach normaler und 0,5 nM BafA1-Vorbehandlung für 12 Stunden (n = 4 biologische Replikate; Daten werden dargestellt). als Mittelwerte ± SD, **p < 0,05, ***p < 0,001).

Tatsächlich erhöhte der Abbau von C11orf54 das Verhältnis von LC3B-II/I signifikant und verringerte das Autophagiesubstrat p62 nach Hunger und Rapamycin-Behandlung (Abb. 7c, d). Darüber hinaus erhöhte sich die Anzahl der Autophagosomen-GFP-LC3-Punkte in C11orf54-Knockdown-Zellen unter normalen und BafA1-Behandlungsbedingungen (Abb. 7e, f). Darüber hinaus könnte eine Vorbehandlung mit BafA1 die Lebensfähigkeit der Zellen und die Fähigkeit zur Koloniebildung in C11orf54-Knockdown-Zellen wiederherstellen (Abb. 7g – i). Die Behandlung mit PI3K-Inhibitoren (Wortmannin und 3-MA), die die frühe Phase der Autophagie unterdrückten, konnte jedoch den Proteinspiegel von HIF1A in C11orf54-Knockdown-Zellen nicht wiederherstellen (ergänzende Abbildung 5b, c). Im Gegenteil könnte die Behandlung mit einem lysosomalen Inhibitor (NH4Cl) die Expression von HIF1A retten (ergänzende Abbildung 5d). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Abbau von C11orf54 die HIF1A-Expression in der Spätphase der Autophagie und der Lysosomen verringert.

Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass HIF1A ein KFERQ-ähnliches Motiv enthielt, das von HSC70 erkannt und gebunden werden konnte und dann auf den multimeren LAMP2A-Komplex auf dem Lysosom für den Abbau durch Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA) gezielt wurde45. Daher fragen wir uns, ob C11orf54 den HIF1A-Abbau durch Chaperon-vermittelte Autophagie reguliert. Zunächst haben wir die Expression der Kernkomponenten der CMA-Maschinerie (HSC70 und LAMP2A) nachgewiesen. C11orf54 hat jedoch keinen Einfluss auf die mRNA- und Proteinspiegel von HSC70 und LAMP2A (ergänzende Abbildung 6a – d).

Dann spekulierten wir, dass C11orf54 das HIF1A-Targeting zum Lysosom und den anschließenden CMA-vermittelten Abbau beeinflussen könnte. Daher führten wir einen Co-Immunpräzipitations-/Massenspektrometrie-Assay (Co-IP/MS) durch, um die Proteine ​​zu identifizieren, die möglicherweise mit C11orf54 interagieren (ergänzende Abbildung 6e). Die Liste der am häufigsten identifizierten C11orf54-Interaktionsproteine ​​wurde in die STRING-Onlinedatenbank hochgeladen, um das Protein-Protein-Interaktionsnetzwerk (PPI) aufzubauen. Anschließend sind in Abb. 8a die Hub-Gene dargestellt, die mithilfe des MCC-Algorithmus (Maximum Clique Centrality) und des CytoHubba-Plugins aus dem PPI-Netzwerk ausgewählt wurden. Die fünf wichtigsten Hub-Gene waren HSPA8, HSPA5, HSP90AA1, HSP90AB1 und HSPA9 (Abb. 8a, b). HSPA8 und HSP90AA1 sind beide an der lysosomalen Membran lokalisiert, von wo aus sie verschiedene Schritte von CMA46 modulieren. HSPA8 (HSC70) ist für das Substrat-Targeting für CMA46 verantwortlich. Der endogene Co-Immunpräzipitationstest bestätigte, dass C11orf54 mit HSC70 interagierte, nicht jedoch mit LAMP2 (Abb. 8c). Darüber hinaus haben wir mit der Online-Software KFERQ Finder V0.8 erkannt, dass C11orf54 zwei KFERQ-ähnliche Motive enthält, die zum phosphorylierungsaktivierten Motiv bzw. zum acetylierungsaktivierten Motiv gehören (Ergänzungstabelle 3). HIF1A enthält ein KFERQ-ähnliches Motiv, das von HSC70 erkannt und interagiert werden könnte. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass C11orf54 und HIF1A kompetitiv mit HSC70 interagieren. Die Wechselwirkung zwischen HIF1A und HSC70 wurde in Gegenwart von C11orf54 eingeschränkt (Abb. 8d). Unterdessen wurde die Bindung von HIF1A und HSC70 mit zunehmender C11orf54-Expression geschwächt (Abb. 8e). Darüber hinaus war die Interaktion zwischen HIF1A und HSC70 in den C11orf54-Knockdown-Zellen verringert, möglicherweise aufgrund der verringerten HIF1A-Expression. Bei der Behandlung mit BafA1 wurden die Expression von HIF1A und seine Interaktion mit HSC70 wiederhergestellt (Abb. 8f). Darüber hinaus wurde die Expression von HIF1A durch doppelten Abbau von C11orf54 und LAMP2A wiederhergestellt (Abb. 8g). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass der Abbau von C11orf54 den CMA-vermittelten HIF1A-Abbau fördert, indem die Interaktion zwischen HIF1A und HSC70 verstärkt wird.

a Die Protein-Protein-Interaktionsnetzwerkanalyse von C11orf54-Bindungsproteinen, die durch Co-IP-MS identifiziert wurden. b Massenspektrum des HSPA8-Bildes. c Immunpräzipitation/Immunoblot-Analyse der Ganzzelllysate (WCLs) und Anti-C11orf54, abgeleitet von PLC/PRF/5-Zellen. Als Negativkontrolle diente IgG. d Immunpräzipitation/Immunoblot-Analyse der Ganzzelllysate (WCLs) und Anti-Flag, abgeleitet von den 293T-Zellen, transfiziert mit Flag-HIF1A und Flag-HIF1A plus pk-Myc-C11orf54 für 48 Stunden. IgG diente als Negativkontrolle (n = 3 biologische Replikate). e Immunpräzipitation/Immunoblot-Analyse der Ganzzelllysate (WCLs) und Anti-Flag, abgeleitet von den 293T-Zellen, transfiziert mit Flag-HIF1A, HA-HSC70 und Gradient pk-Myc-C11orf54 für 48 Stunden. IgG diente als Negativkontrolle (n = 3 biologische Replikate). f Immunpräzipitation/Immunoblot-Analyse der Ganzzelllysate (WCLs) und Anti-HIF1A, abgeleitet von den PLC/PRF/5-Zellen unter Kontrolle und 100 nM BafA1-Behandlung für 8 Stunden. IgG diente als Negativkontrolle (n = 3 biologische Replikate). g Western Blots der angegebenen Proteine ​​in Kontroll-, C11orf54-Knockdown- und C11orf54-, LAMP2A-Double-Knockdown-Zellen.

In dieser Studie wollten wir eine neuartige biologische Wirkung von C11orf54 bei Säugetieren beschreiben. Wir haben gezeigt, dass der Abbau von C11orf54 die Zellproliferation verringert und die Cisplatin-induzierte DNA-Schädigung und Apoptose verstärkt. Mechanistisch interagieren C11orf54 und HIF1A kompetitiv mit HSC70, dem entscheidenden Effektor der Chaperon-vermittelten Autophagie, und der Abbau von C11orf54 fördert den CMA-vermittelten Abbau von HIF1A. Darüber hinaus reduzierte der C11orf54-Knockdown-vermittelte HIF1A-Abbau die Transkription der Ribonukleotidreduktase-regulatorischen Untereinheit M2 (RRM2), einem geschwindigkeitsbestimmenden RNR-Enzym für die DNA-Synthese und DNA-Reparatur, indem es dNTPs produziert. Die Ergänzung von dNTPs könnte C11orf54-Knockdown-vermittelte DNA-Schäden und Zelltod teilweise retten. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass der autophagische Inhibitor BafA1 den Proteinspiegel von HIF1A und den mRNA-Spiegel von RRM2 retten und dann die verringerte Zellproliferation von C11orf54-Knockdown-Zellen wiederherstellen kann. Andererseits verringerte der Verlust von C11orf54 die Rad51-Expression und die Kernakkumulation, was zu einer Unterdrückung der homologen Rekombinationsreparatur führte (Abb. 9).

Einerseits verringert der Verlust von C11orf54 die Rad51-Expression und die nukleare Akkumulation. Andererseits fördert der Abbau von C11orf54 die Bindung von HSC70 an HIF1A, um es durch Chaperon-vermittelte Autophagie (CMA) abzubauen, was zu einer Herunterregulierung von RRM2 führt. Das Fehlen von C11orf54 führt schließlich zur Unterdrückung der homologen Rekombinationsreparatur.

C11orf54 ist ein hochkonservatives Gen bei verschiedenen Arten und kommt reichlich in Nieren- und Lebergewebe vor. Die biologische Rolle von C11orf54 war unklar und die subzelluläre Lokalisierung war immer noch umstritten. Conrad et al. enthüllte seinen nuklearen Standort durch einen automatischen Phänotypisierungsansatz27. Allerdings war C11orf54 vorwiegend im Zytoplasma lokalisiert und konnte bei Transfektion mit C11orf54-eGFP sowohl im Zytoplasma als auch im Zellkern existieren28. Hier haben wir die Lokalisierung von endogenem C11orf54 mit zwei verifizierten Antikörpern durch den Kern-/Zytosolfraktionierungstest und die Immunfärbungsanalyse getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass sich C11orf54 hauptsächlich im Zytoplasma befand (Abb. 1d – g). C11orf54 wurde durch zweidimensionale Gelelektrophorese gekoppelt mit Massenspektrometrie als Biomarkerprotein für Endometriumkrebs, Nierenzellkarzinom und klarzelliges Nierenzellkarzinom identifiziert24,25,26. Allerdings war C11orf54 in Nierenzellkarzinomgeweben im Vergleich zu den entsprechenden normalen Geweben herunterreguliert24,25,26. Darüber hinaus haben wir durch die Analyse der Expression von C11orf54 in mehreren Krebsgewebeproben basierend auf TCGA-Daten mithilfe der GEPIA-Website festgestellt, dass C11orf54 in den meisten Krebsgeweben eine geringe Expression aufwies, insbesondere in KICH (Kidney Chromophobe) und KIRP (Nieren-Papillenzellkarzinom). ) und SARC (Sarkom; ergänzende Abb. 7). In unserer Studie könnte der Abbau von C11orf54 DNA-Schäden verursachen und die Proliferation hemmen (Abb. 2–3). Diese legen nahe, dass die c11orf54-Expression im Krebsgewebe durch einen unbekannten Mechanismus verringert wird, bei dem es sich möglicherweise um eine Rückkopplungsschleife handelt, die das Überleben der Tumorzellen blockiert.

Homologe Rekombination (HR) und nicht homologe Endverbindung (NHEJ) sind die Hauptwege für die DSB-Reparatur; Rad51 und Ku70 sind jeweils zwei wichtige Regulatoren47,48. In unserer Studie hemmt der Abbau von C11orf54 die Expression von Rad51 statt von ku70, was darauf hindeutet, dass C11orf54 die HR-Reparatur beeinflussen könnte. Wir verwendeten das HR-Reportersystem und stellten fest, dass der Abbau von C11orf54 die Fähigkeit zur homologen Rekombination hemmte. Unterdessen wurde die Clearance von p-H2A.X-Herden im zeitlichen Verlauf der Erholung nach dem C11orf54-Knockdown gehemmt.

Proteomische Studien haben gezeigt, dass das homologe C11orf54-Protein in der Skelettmuskulatur von Mäusen mit Insulinresistenz zunahm, was darauf hindeutet, dass dies möglicherweise mit dem Signalweg für Proteinfaltung/-abbau zusammenhängt49. Unsere Ergebnisse zeigen, dass ein C11orf54-Mangel den Abbau des Makroautophagie-Substrats p62 und die Akkumulation von LC3-II fördert, was die Aktivierung der Makroautophagie bedeutet (Abb. 6c – f). Der Autophagie-Lysosomen-Weg ist einer der beiden Hauptwege für den intrazellulären Proteinabbau50.

Darüber hinaus stellten wir fest, dass der Abbau von C11orf54 den CMA-vermittelten HIF1A-Abbau förderte (Abb. 7c – f). Mechanistisch könnte C11orf54 mit HSC70 konkurrieren, um die HIF1A-HSC70-Wechselwirkung zu dissoziieren. Durch den Abbau von C11orf54 wurde seine Wechselwirkung mit HSC70 aufgehoben, was zu einer verstärkten Wechselwirkung zwischen HSC70 und HIF1A führte und schließlich den CMA-medikamentösen HIF1A-Abbau förderte (Abb. 8e, f). Übereinstimmend zeigte eine frühere Studie, dass HIF1A durch CMA über die Interaktion mit HSC70 und LAMP2A45 abgebaut werden könnte. Frühere Studien zeigten, dass Makroautophagie und Chaperon-vermittelte Autophagie beim Proteinabbau komplementär sind51. Jüngste Studien legen nahe, dass Makroautophagie und CMA aktiviert werden könnten, wenn Zellen auf Stressreize treffen52,53. Hier haben wir bewiesen, dass der Verlust von C11orf54 sowohl die Makroautophagie als auch die Chaperon-vermittelte Autophagie aktivieren kann. Der Mechanismus, wie C11orf54 die Autophagie reguliert, war jedoch noch unklar und muss in zukünftigen Arbeiten weiter untersucht werden.

Eine frühere Studie ergab, dass die Aktivierung des HIF1A/STAT3-Signals die RRM2-mRNA-Expression hochregulieren könnte44, und wir entdeckten auch, dass die Hemmung des HIF1A-Abbaus mit BafA1 RRM2 auf mRNA-Ebene teilweise retten könnte. Der RRM2-Spiegel schwankt während des Zellzyklus, steigt während der späten G1-/frühen S-Phase an und wird in der späten S-Phase abgebaut. Die RRM2-Spiegel werden durch die APCCdh1-Ubiquitin-Ligase unter Kontrolle gehalten, um eine RRM2-Akkumulation in der G1-Phase zu verhindern54. Darüber hinaus wird RRM2 in der G2-Phase nach der CDK-vermittelten Phosphorylierung über Cylin F55 abgebaut. Darüber hinaus zeigte eine aktuelle Studie, dass die Herunterregulierung von RRM2 durch siRNA oder die Behandlung mit dem RNR-Inhibitor Hydroxyharnstoff die Autophagie erheblich induzierte. RRM2 ist jedoch auf einen Proteasom-abhängigen, aber Autolysosomen-unabhängigen Abbau bei der Induktion von Autophagie ausgerichtet56. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Abbau von C11orf54 den RRM2-Spiegel durch einen verringerten mRNA- und Proteinspiegel senkte (Abb. 6a – c). Die Ergänzung von dNTPs konnte die Rad51-Expression nicht retten, konnte jedoch die durch C11orf54-Knockdown vermittelte DNA-Schädigung und Zellproliferation teilweise wiederherstellen, was bedeutet, dass es möglicherweise einen alternativen Mechanismus gibt, der die HR beeinflusst. Unterdessen fördert der Abbau von C11orf54 die Autophagie (Abb. 7). Hydroxyharnstoff ist ein bewährter RNR-Inhibitor, indem er das freie Radikal und das Eisenzentrum von RRM257 reduziert. In unserer Studie fördern Hydroxyharnstoff, Camptothecin und Cisplatin die Expression von C11orf54 zeitabhängig (Abb. 2f, g und ergänzende Abb. 3a – d). Daher muss auch das genaue Regulationsnetzwerk zwischen C11orf54, RRM2 und Autophagie weiter untersucht werden.

Zusammenfassend haben wir eine Rolle von C11orf54 bei der Regulierung von DNA-Schäden und -Reparatur durch CMA-vermittelten Abbau von HIF1A entdeckt, was zu einem reduzierten RRM2 führt. C11orf54 könnte kompetitiv mit HSC70 interagieren und das HIF1A-Ziel für den CMA-Abbau unterdrücken. Die Behandlung mit BafA1 oder dNTPs könnte die durch C11orf54-Knockdown vermittelte DNA-Schädigung und Proliferationshemmung teilweise beheben.

PLC/PRF/5- und 293T-Zellen wurden von der Shanghai Cell Bank, Type Culture Collection Committee, Chinese Academy of Sciences, erworben. Alle diese Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Hyclone) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Gibco), bei 37 °C und 5 % CO2 gezüchtet.

Für das Überexpressionsplasmid wurde das C11orf54-CDS aus 293T-Zell-cDNAs unter Verwendung der in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführten PCR-Amplifikationsprimer kloniert. Der pk-Myc-Vektor wurde mit BamHI und NotI verdaut, um den Vektor zu linearisieren, und dann wurde das C11orf54-CDS ligiert und der Vektor mit T4-Ligase linearisiert .

Verwenden Sie für das shRNA-Design den BLOCK-iT™RNAi Designer (http://rnaidesigner.thermofisher.com/), um zwei Ziele mit der höchsten Bewertung für C11orf54 zu bestimmen. Zwei Zielsequenzen sind wie folgt:

shC11orf54-1: 5′-GGTGCCTACTGGAGAAATACA-3′;

shC11orf54-2: 5′-CCAGGTCTCTGTAGTTGATTG-3′.

Der pLKO.1-Vektor wurde mit EcoRI und AgeI verdaut und dann durch die T4-Ligase mit shRNA-Oligos ligiert.

Um Lentivirus herzustellen, haben wir shC11orf54-Plasmide mit psPAX2 und pMD2.G unter Verwendung von Polyethylenimin (PEI)-Transfektionsreagenz in 293T-Zellen cotransfiziert. Die lentiviralen Überstände wurden 48 und 72 Stunden nach der Transfektion geerntet und dann PLC/PRF/5- und 293T-Zellen infiziert. Die Zellen wurden 3 Tage nach der Infektion in 1 μg/ml Puromycin-haltigem Medium selektiert.

Die Gesamt-RNA wurde mit dem RNAiso Plus Regent (TaKaRa) gemäß den Anweisungen des Herstellers aus Zellen extrahiert. RNA wurde unter Verwendung des ABScript II First Strand Synthesis Kit (Abclonal) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers in cDNA transkribiert. Die quantitative Reverse-Transkriptions-PCR (qRT-PCR) wurde mit SYBR Green Master Mix (Abclonal) auf einem CFX96-Echtzeitsystem (Bio-Rad) durchgeführt. Die relativen mRNA-Spiegel wurden mithilfe der 2-ΔΔCt-Methode berechnet, wobei Actb als interne Kontrolle verwendet wurde. Primersequenzen für Zielgene sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Proteine ​​wurden in eiskaltem RIPA-Puffer (Beyotime) mit Proteinaseinhibitoren isoliert und die Proteinkonzentrationen durch den Bicinchoninsäure-Assay (BCA) bestimmt. Die Proteine ​​wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese fraktioniert, auf die Poly(vinylidendifluorid)-Membran (Millipore) elektrogeblottet und mit primären und sekundären Antikörpern sondiert. Die verwendeten primären und sekundären Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Die von den Antikörpern erkannten Proteinbanden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz (Beyotime) sichtbar gemacht und mithilfe von Image J ausgewertet.

Die Zellen wurden auf einem Deckglas bis zu einer Konfluenz von 60 % gezüchtet. Nach der Behandlung wurden die Zellen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Zugänglichkeit von Antigenen wurde durch die Behandlung mit 0,2 % Triton X-100 erhöht und mit 3 % Rinderserumalbumin blockiert. Die Zellen wurden mit Primärantikörpern über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach dem Waschen mit PBST 1 Stunde lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit Alexa Fluor 594-konjugiertem Anti-Kaninchen-IgG gefärbt. Nach der DAPI-Färbung wurden die Zellen mit einem konfokalen Leica TCS SP8-Mikroskop abgebildet. Zur Quantifizierung der Kolokalisierung wurden die Bilder vorverarbeitet, indem ein mit einem Medianfilter verarbeitetes Bild und ein Hintergrund subtrahiert wurden, und dann wurden die Bilder mit Bild J fortgesetzt.

Die Kern-/zytosolischen Fraktionierungstests wurden mit dem Nuclear and Cytoplasmic Protein Extraction Kit (Beyotime) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt, 2 × 106 Zellen wurden 5 s lang mit Zytoplasma-Extraktionsreagenz A verwirbelt und 15 min lang auf Eis inkubiert. Zugabe von Zytoplasma-Extraktionsreagenz B und Inkubation auf Eis für 1 Minute nach 5 Sekunden Vortex, dann Zentrifugation bei 4 °C für 5 Minuten bei 12.000 g. Der Überstand wurde einer zytosolischen Fraktionierung unterzogen. Dann wurde das Kernpellet dreimal mit eiskaltem PBS gewaschen und mit Kernextraktionsreagenz resuspendiert und dann alle 2 Minuten 30 Sekunden lang verwirbelt, insgesamt 30 Minuten lang. Zentrifugieren bei 4 °C für 10 Minuten bei 12.000 g und der Überstand wurde einer Kernfraktionierung unterzogen.

PLC/PRF/5- und 293T-Zellen wurden in 10-cm-Schalen ausgesät und mit den angegebenen Plasmiden transfiziert. Zwei Tage nach der Transfektion wurden die Zellen mit Western/IP-Puffer auf Eis lysiert und anschließend mit Ultraschall behandelt. Die Proteinkonzentrationen wurden im Bicinchoninsäure-Assay (BCA) bestimmt. Flag- oder HIF1α-Antikörper wurden zur Immunpräzipitation von endogenem HSC70 verwendet. Die Niederschläge wurden gekocht und für den Western-Blot mit dem Sekundärantikörper VeriBlot zur IP-Detektion auf SDS-PAGE-Gele geladen.

Die Zellapoptose wurde mittels Durchflusszytometrie unter Verwendung des Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Beyotime) gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, die Zellen wurden nach der Behandlung trypsiniert, mit PBS gewaschen, in Bindungspuffer resuspendiert und mit Färbelösung (Annexin V/PI = 2:1) im Dunkeln 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Unmittelbar nach der Annexin V/PI-Färbung wurde eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierungsanalyse (FACS) mit BD FACS VERSE durchgeführt.

Die TUNEL-Färbung erfolgte mit dem One Step TUNEL Apoptosis Assay Kit (Beyotime) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, nach 24-stündiger Cisplatin-Behandlung wurden die Zellen 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann mit 0,2 % Triton X-100 5 Minuten lang bei Raumtemperatur permeabilisiert. Nach dem Waschen mit PBS Inkubation der Zellen mit TUNEL-Testlösung (Markierungspuffer/TdT-Enzym = 9:1) im Dunkeln für 60 Minuten bei 37 °C. Abschließend wurden die Zellen mit Zeiss Axio Imager.Z2 abgebildet.

CCK-8 (Solarbio) wurde zur Beurteilung der Zellproliferation gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einer Dichte von 1 × 103 Zellen/Well ausgesät und dann 24 Stunden lang in einem Inkubator kultiviert, bevor sie am Tag 1, -2, -3, -4 bzw. -5 ausgewertet wurden . Dann wurde CCK-8-Lösung in jede Vertiefung getropft und die Platte für zwei Stunden in den Inkubator überführt. Schließlich wurde mit dem MD SpectraMax 190 ein OD-Wert bei 450 nm ermittelt.

Etwa 1 × 103 pLKO.1- und shC11orf54 PLC/PRF/5-Zellen wurden in eine Platte mit sechs Vertiefungen ausgesät und mit der angegebenen Konzentration an Cisplatin behandelt. Die Zellen wurden 10 Tage lang kultiviert und zur Fixierung der Zellen wurde 4 % Paraformaldehyd verwendet, gefolgt von einer einstündigen Färbung mit 0,5 % Kristallviolett. Die Anzahl der Kolonien (> 50 Zellen/Kolonie) wurde mit einem Stereomikroskop gezählt und mit der Image J-Software analysiert58. Alle Proben wurden in dreifacher Ausfertigung durchgeführt.

Für die EdU-Färbung wurde das BeyoClick™ EdU-594 Kit (Beyotime) gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, 10 μM EdU wurden dem frischen Medium zugesetzt und dann 2 Stunden lang bei 37 °C/5 % CO2 inkubiert, als die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreicht hatten. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur 20 Minuten lang fixiert. Anschließend wurden die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Reaktionspuffer im Dunkeln inkubiert. Nach der DAPI-Färbung wurden die Zellen mit Nikon Ti2 abgebildet, um die Anzahl der EdU-positiven Zellen sichtbar zu machen. Die Positivrate wurde mit Image Pro Plus 6 ermittelt.

Die Comet-Tests wurden wie in unserer vorherigen Studie mit dem COMET-Testkit (Enzo) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt59. Zellen bei 1 × 105/ml mit geschmolzener LM-Agarose im Verhältnis 1:10 (Vol./Vol.) kombinieren und sofort auf einen COMET-Objektträger pipettieren. Legen Sie die Objektträger 30 Minuten lang flach bei 4 °C ins Dunkel und tauchen Sie sie dann 30 Minuten lang in die vorgekühlte Lyselösung bei 4 °C. Die Objektträger wurden entnommen, überschüssiger Puffer vorsichtig mit Klebeband von den Objektträgern abgeklebt, in TBE-Puffer gewaschen und dann in eine horizontale Elektrophoresekammer überführt. Eine Spannung (1 V/cm) wurde 10 Minuten lang angelegt. Überschüssiges FSME sehr vorsichtig abkleben, Objektträger 5 Minuten lang in 70 %iges Ethanol tauchen und Proben an der Luft trocknen. Die Objektträger wurden mit SYBR Green gefärbt und dann mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Insgesamt wurden in jeder Probe 70–150 Zellen mit dem COMET Assay Software Project (CASP-Software) ausgewertet. Schwanz-DNA % = Schwanz-DNA/ (Schwanz-DNA + Kopf-DNA), Schwanzmoment = Schwanzlänge × Schwanz-DNA %.

Der HR-Reparaturaktivitätstest wurde wie in der vorherigen Studie durchgeführt37. Kurz gesagt, pLKO.1- und shC11orf54 PLC/PRF/5-Zellen wurden mit pDR-GFP und pCBA-SceI transfiziert. Nach zwei Tagen wurden die Zellen geerntet und mittels fluoreszenzaktivierter Durchflusszytometrie (FACS) analysiert, um den Prozentsatz an GFP-positiven Zellen zu untersuchen. Die Gating-Strategien sind in der ergänzenden Abbildung 8 dargestellt.

Die Gesamt-RNA wurde aus den pLKO.1- und shC11orf54 PLC/PRF/5-Zellen extrahiert. Die RNA wurde dann vom WuXiNextCODE Tec RNA-seq-Dienst sequenziert (n = 2). Die GO-Analyse der signifikanten Veränderungen der differentiell exprimierten Gene wurde mithilfe der Metascape-Website (https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)60 durchgeführt. Für die Gen-Set-Anreicherungsanalyse haben wir GSEA v4.1.0 auf verschiedene funktionale charakteristische Gensignaturen angewendet, wie zuvor beschrieben61,62. GSEA wurde unter Verwendung der Gensätze „Hallmark“ oder „KEGG“ durchgeführt, um angereicherte Signaturen zu identifizieren. Gensätze mit einem FDR < 0,25 und einem nominalen p-Wert von < 0,05 wurden als signifikant angesehen.

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt. Das Niveau der statistischen Signifikanz wurde unter Verwendung eines ungepaarten zweiseitigen Student-t-Tests auf p < 0,05 festgelegt. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001. Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism-Software durchgeführt. Die Proben- und Replikatgröße wurde in den Legenden der Abbildungen angegeben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten RNA-seq-Daten wurden in der Sequence Read Archive (SRA)-Datenbank unter dem Zugangscode PRJNA939822, Proben-IDs: SRR23648017, SRR23648018, SRR23648019 und SRR23648020, hinterlegt. Die unbearbeiteten/nicht zugeschnittenen Western-Blot-Gele sind in der ergänzenden Abbildung 9 enthalten. Die Quelldaten hinter den Grafiken im Artikel sind in den ergänzenden Daten 1 enthalten. Alle anderen Daten sind auf begründete Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Guo Chen von der Jinan University für die pDR-GFP- und pCBA-SceI-Plasmide. Diese Arbeit wurde finanziell unterstützt vom National Key R&D Program of China (2021YFA0804903), der National Natural Science Foundation of China (Grants. 32170772, 32270810, 81800833 und 81802189), dem 111 Project (B16021) und der Natural Science Foundation of Provinz Guangdong (Zuschuss 2021A1515011227, 2022A1515140040, 2019A1515011847 und 2019A1515010591). QZ dankt außerdem der KC Wong Education Foundation für ihre Unterstützung.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Junyang Tan, Wenjun Wang.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Jianshuang Li, Qinghua Zhou.

Das sechste angegliederte Krankenhaus der Jinan-Universität, Jinan-Universität, 523573, Dongguan, Guangdong, China

Junyang Tan, Wenjun Wang, Xinjie Liu, Jinhong Xu, Yaping Che, Yanyan Liu, Jiaqiao Hu, Liubing Hu, Jianshuang Li und Qinghua Zhou

Das Biomedical Translational Research Institute, Health Science Center (School of Medicine), Jinan University, 510632, Guangzhou, Guangdong, China

Junyang Tan, Wenjun Wang, Xinjie Liu, Jinhong Xu, Yaping Che, Yanyan Liu, Jiaqiao Hu, Liubing Hu, Jianshuang Li und Qinghua Zhou

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Das Projekt wurde von JL und QZ betreut. Die Experimente wurden von JL und QZ entworfen und von JT, WW, XL, JX, YC, YL, JH und LH durchgeführt. JT, WW und JL analysierten die Daten. JT, WW, JL und QZ haben das Manuskript geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript rezensiert.

Korrespondenz mit Jianshuang Li oder Qinghua Zhou.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptherausgeber: Christina Karlsson Rosenthal. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Tan, J., Wang, W., Liu, X. et al. C11orf54 fördert die DNA-Reparatur, indem es den CMA-vermittelten Abbau von HIF1A blockiert. Commun Biol 6, 606 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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Eingegangen: 23. September 2022

Angenommen: 19. Mai 2023

Veröffentlicht: 05. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04957-1

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