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Jul 13, 2023

Analyse von β

Wissenschaftliche Berichte Band 13,

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9180 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Der β-Nervenwachstumsfaktor (NGF) ist ein Neurotrophin, das eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung des Fötus während der Schwangerschaft spielt. ProNGF ist die Vorläuferform von NGF mit einem ausgeprägten biologischen Profil. Um die Rolle von NGF und proNGF bei schwangeren Frauen zu untersuchen, wurde ein empfindlicher und selektiver Immunaffinitäts-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Assay entwickelt und qualifiziert, um gleichzeitig die Konzentrationen von Gesamt-NGF (tNGF; Summe aus reifem und proNGF) und proNGF zu messen unter Verwendung vollständiger bzw. relativer Quantifizierungsstrategien. Der Assay wurde verwendet, um die Serum-tNGF- und proNGF-Spiegel in den drei Schwangerschaftstrimestern der Schwangerschaft und bei nicht schwangeren weiblichen Kontrollpersonen zu bestimmen. Der mittlere tNGF ± SD betrug 44,6 ± 12,3, 42,6 ± 9,3, 65,4 ± 17,6 und 77,0 ± 17,8 pg/ml für nicht schwangere, erste, zweite und dritte Trimester, was keinen signifikanten Anstieg des zirkulierenden tNGF zwischen der Kontrolle und dem zeigt im ersten Trimester und ein moderater, aber signifikanter 1,7-facher Anstieg während der Schwangerschaft. Die proNGF-Werte blieben im ersten Trimester im Vergleich zur Kontrolle unverändert. Im Gegensatz zu tNGF blieben die proNGF-Spiegel während der Schwangerschaft jedoch ohne signifikante Veränderungen stabil. Die Entwicklung dieses empfindlichen, neuartigen Immunaffinitäts-Duplex-Assays für tNGF und proNGF soll eine weitere Aufklärung der Rolle dieser Neurotrophine in der menschlichen Schwangerschaft sowie in anderen Modellen ermöglichen.

Der β-Nervenwachstumsfaktor (NGF) und sein Vorläufer proNGF sind wichtige Neurotrophine mit unterschiedlichen Funktionen. NGF fördert das Wachstum, die Entwicklung und die Differenzierung von Neuronen und ist im Allgemeinen neuroprotektiv1, während proNGF scheinbar widersprüchliche Funktionen aufweist2 und bei Schilddrüsenkrebs im Vergleich zu normalen Krebserkrankungen überexprimiert wurde3. Veröffentlichte Berichte weisen sowohl auf eine Unterstützung des Wachstums und Überlebens von Neuronen4,5 als auch auf das Absterben von Neuronen hin6,7. proNGF ist die dominierende Form, die im Gehirn existiert, wobei nur wenig bis gar kein reifer NGF vorhanden ist8,9. Interessanterweise scheint die Rolle des Verhältnisses von proNGF zu reifem NGF in Nervenzellen10,11 und anschließend die Rolle der Rezeptorexpression und -signalisierung8,12,13 durch diese unterschiedlichen Proteine ​​wichtige Faktoren bei neurodegenerativen Erkrankungen zu sein14,15. Die beiden Proteine ​​befinden sich im Gleichgewicht, und die Veränderung dieses Gleichgewichts kann dazu führen, dass sie gegensätzlich wirken16. Beispielsweise trägt eine fehlerhafte Reifung von NGF, die zu einem höheren Verhältnis von proNGF zu reifem NGF im Gehirn von Ratten führt, zum frühen Fortschreiten einer experimentell induzierten diabetischen Enzephalopathie bei17. Darüber hinaus scheint ein unausgewogenes Verhältnis zwischen proNGF und reifem NGF ein Frühindikator für Komplikationen aufgrund von Diabetes im Allgemeinen zu sein18. Eine fehlerhafte Regulierung oder Fehlfunktion von NGF kann auch mit neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit19,20,21,22, altersbedingter Makuladegeneration23,24,25,26, Netzhautschäden27 und Multipler Sklerose28 in Zusammenhang stehen, und NGF wurde auch für a untersucht therapeutische Rolle bei der neurodegenerativen Erkrankung Glaukom24. Seit seiner Entdeckung und Isolierung29,30 ist bekannt, dass NGF Auswirkungen auf die Entwicklung des Nervensystems hat31,32,33 und eine Schlüsselrolle bei der nozizeptiven Modulation bei Erwachsenen spielt34,35. Daher wurde NGF umfassend auf seine therapeutische Bedeutung hin untersucht und wird zunehmend als potenzielles therapeutisches Ziel bei nozizeptiven Schmerzen und in der Onkologie verfolgt36,37.

Neurotrophine sind auch an Prozessen im Zusammenhang mit der Schwangerschaft beteiligt. Es wurde gezeigt, dass sowohl die mütterliche als auch die fötale NGF-Expression im ersten bis dritten Trimester der Schwangerschaft erhöht ist, was sowohl bei der Eiimplantation als auch bei der Erhöhung der mütterlichen Vaskularität in den späten Stadien der Schwangerschaft eine wichtige Rolle spielt38,39. Es hat sich gezeigt, dass eine NGF-Supplementierung die Vaskularisierung des Endometriums bei bestimmten Säugetieren erhöht40, was eine Vaskularitätskompensation für erhöhten NGF im Plazentakreislauf bei Präeklampsiegeburten erklären könnte41, während niedrigere NGF-Spiegel im Nabelschnurplasma und in der Plazenta mit Frühgeburten verbunden sind42. Darüber hinaus sind niedrigere NGF-Werte aufgrund eines externen Faktors wie Opioidabhängigkeit mit deutlich höheren unerwünschten Schwangerschaftsergebnissen verbunden, einschließlich kognitiver Anomalien, Tod von Neugeborenen, Atemwegsproblemen und niedrigeren Apgar-Werten43.

Das Verhältnis von proNGF zu reifem NGF spielt möglicherweise auch eine ähnliche Rolle wie bei neurodegenerativen Erkrankungen, wie oben beschrieben, ist aber wahrscheinlich für den Zusammenbruch der sympathischen Uterusnerven während der Schwangerschaft und die Reinnervation der Uterusnerven während der Erholung nach der Geburt verantwortlich44,45, und eine unausgeglichene NGF-Verteilung im Plazentagewebe ist mit Fehlgeburten beim Menschen verbunden46. Es wurde gezeigt, dass die NGF-Spiegel bei menschlichen Neugeborenen am 4. Tag im Vergleich zu Nabelschnurblut erhöht waren (nach einem anfänglichen Rückgang am Tag 1), während andere Neurotrophine deutlich abnahmen47. Neben den positiven Zusammenhängen spezifischer Interleukine mit Insulinresistenz und -sekretion war der NGF bei Schwangerschaftsdiabetespatientinnen höher und stand im zweiten Trimester in engem Zusammenhang mit dem Glukosestoffwechsel, der Insulinresistenz und der Funktion der β-Zellen der Bauchspeicheldrüse bei schwangeren chinesischen Frauen.

Frühere Arbeiten mit dem LCMS-Assay für NGF zeigten einen starken und kontinuierlichen Anstieg der NGF-Expression (bis zu ~ 78-fach) während der Trächtigkeit bei Javaneraffen, ohne Unterschied in den zirkulierenden Spiegeln zwischen männlichen und nicht schwangeren weiblichen Kontrollpopulationen48. Obwohl bei Javaneraffen ein starker Anstieg der zirkulierenden tNGF-Spiegel festgestellt wurde48, wurde dieses Phänomen in der Schwangerschaft beim Menschen nicht beobachtet, was auf artspezifische Unterschiede während der Schwangerschaft hinzudeuten scheint. Während ein Gleichgewicht der systemischen NGF-Spiegel für einen optimalen Schwangerschaftsverlauf wichtig ist, zeigte die NGF-mRNA-Expression bei normaler Schwangerschaft beim Menschen im Vergleich zu spontan abortiven Patientinnen aus isolierten Trophoblasten bei letzteren einen ~ 2- bis 8-fachen Anstieg. Dieses Ergebnis stimmte mit dem Spontanabort in Mausmodellen überein, wenn in der Frühschwangerschaft eine supraphysiologische Dosis NGF verabreicht wurde46, und es wurde gezeigt, dass die NGF-Spiegel bei säugenden Mäusen nach der Schwangerschaft anstiegen49. Interessanterweise sind die NGF-Spiegel im Uterus von Ratten während der mittleren und späten Trächtigkeit im Vergleich zu Kontrollen verringert, was mit der bekannten Degeneration des Myometriumnervs korreliert45. In ähnlicher Weise ist die NGF-Expression bei Diabetes mellitus erhöht und erwies sich als Schutzfaktor bei diabetischer Neuropathie und Vaskulopathie50,51,52,53, war aber auch erhöht und mit der Insulinresistenz bei chinesischen Frauen mit Schwangerschaftsdiabetes im zweiten Trimester verbunden54. Lobos et al. zeigten außerdem, dass die proNGF-Spiegel während der Schwangerschaft ansteigen, möglicherweise aufgrund einer beeinträchtigten Verarbeitung der Pro-Form zur reifen Form44,45.

Insgesamt haben die oben genannten Studien das Wissen über die verschiedenen Rollen von NGF und proNGF während der Schwangerschaft erweitert. Allerdings wurden die NGF- und proNGF-Analyse im Großen und Ganzen ohne qualifizierte, selektive Tests durchgeführt und die gemeldeten Datensätze scheinen sowohl vergleichbar als auch unterschiedlich zu sein. Es bleibt daher unbestätigt, ob die gemeldeten Unterschiede in den NGF- und proNGF-Konzentrationen und damit die daraus gezogenen Schlussfolgerungen zumindest in einigen Fällen durch Assay-Unterschiede und Variabilität verfälscht werden16. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, die proNGF- und NGF-Tests zu charakterisieren, möglicherweise zu verbessern und zu qualifizieren, um Vertrauen in die Schlussfolgerungen zu gewinnen16.

Unter Verwendung eines zuvor qualifizierten Immunaffinitäts-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Ansatzes (IA-LC–MS/MS) zur Quantifizierung von tNGF in menschlichem Serum55,56,57 haben wir den Assay um eine relative Quantifizierung von proNGF erweitert. Mit dieser Analyse unter Verwendung eines hochselektiven und empfindlichen Massenspektrometrie-Assays wollen wir die tNGF-Spiegel während der menschlichen Schwangerschaft bestätigen und ein relatives quantitatives Maß für das Vorläuferprotein einbeziehen. Die Fähigkeit des Tests, proNGF zu erkennen, ermöglicht die Beurteilung von Veränderungen der proNGF-Serumspiegel während der Schwangerschaft. Wir haben diesen Ansatz verwendet, um die tNGF- und proNGF-Spiegel im Serum schwangerer Frauen in der Mitte jedes Trimesters im Vergleich zu einer nicht schwangeren weiblichen Kohorte zu bewerten. Diese Daten können nun verwendet werden, um die Rolle von NGF und proNGF während der Schwangerschaft beim Menschen besser zu verstehen.

Ein Ersatzpeptid für proNGF war notwendig, um eine äquimolare Darstellung des proNGF-Proteins zu erhalten; Das bedeutet, dass für jedes Mol proNGF nach der Behandlung mit Trypsin 1 Mol des Ersatzpeptids erzeugt werden musste. Ein von der Propeptidregion von proNGF abgeleitetes tryptisches Peptid VLFSTQPPR wurde auf der Grundlage spezifischer Kriterien ausgewählt, um die Ziele des hier beschriebenen Tests zu erfüllen: hauptsächlich die Spezifität für das proNGF-Peptid in einer Domäne, die in der reifen Form von NGF nicht vorhanden ist; zweitens eine hohe vorhergesagte Antigenität, die die Bildung eines spezifischen Antipeptid-Antikörpers ermöglicht; schließlich die Fähigkeit, im Massenspektrometer ein robustes Signal zu erzielen. Das zweite in dieser Studie verwendete tryptische Peptid war IDTACVCVLSR, das zuvor in LC-MS/MS-Assays für NGF-Messungen verwendet wurde. Die Auswahlkriterien für das Peptid IDTACVCVLSR wurden bereits beschrieben55. Dieses Peptid stammt aus der Nähe des C-Terminus sowohl des reifen NGF- als auch des proNGF-Proteins und stellt daher Beiträge beider Proteinformen in einer kombinierten tNGF-Messung dar.

Für die Entwicklung des Assays ist es erforderlich, dass der für diesen Assay verwendete Fängerantikörper in der Lage ist, sowohl reifen NGF als auch proNGF zu binden. Die Bindung des polyklonalen Fängerantikörpers an beide Proteine ​​wird durch den spezifischen Nachweis beider Ersatzpeptide bestätigt. Darüber hinaus bestätigte vor der Qualifizierungsstudie eine wiederholte Untersuchung der Überstände nach der Antikörperanreicherung aus menschlichem Serum, dass der Fängerantikörper beide Proteinformen nahezu vollständig zurückgewinnt.

Die Methode wurde mit drei einzelnen Chargenläufen qualifiziert, die an verschiedenen Tagen durchgeführt wurden. Der Quantifizierungsbereich für tNGF im Humanserum beträgt 10,0–640 pg/ml unter Verwendung von Akzeptanzkriterien für die relative Genauigkeit von < 25 % (30 % bei LLOQ). In den endgültigen Kurven wurden acht Kalibrierungsstandardkonzentrationsniveaus (einschließlich des 0-Punkts) dargestellt, wobei mindestens sechs Nicht-Null-Punkte erforderlich waren. Eine typische Kalibrierungskurve, die während der Assay-Qualifizierung erhalten wurde, ist in Abb. 1A dargestellt. Der CV-Bereich für alle Kalibrierungsstandards betrug 4,80 bis 16,6 % und ein RE-Bereich von –5,20 bis 12,4 %. Während der drei separaten Chargenläufe wurden nur vier einzelne Kalibrierungspunkte aus den Kalibrierungskurven entfernt. Außerhalb der Akzeptanz wurden einzelne Kurvenpunkte entfernt und die Kurvenanpassung erneut zurückgebildet. Die tNGF-Präzision und die relative Genauigkeit wurden während der gesamten Qualifizierungsstudie in derselben Serumcharge bewertet, was einen Inter-Assay-Mittelwert von 30,0 pg/ml (QC2; endogener tNGF-Spiegel) ergab, wobei die zweifache Verdünnung von QC2 (QC1) einen Inter-Assay aufwies Mittelwert von 12,8 pg/ml. Für die aufgestockten QCs, also QC3 und QC4, wurde der ermittelte Inter-Assay-Mittelwert für den endogenen NGF-Gehalt in QC2 zur aufgestockten NGF-Konzentration addiert, um die relative Genauigkeit zu berechnen. Individuelle, Intra- und Inter-Assay-QC-Daten und zusammenfassende Statistiken für tNGF sind in Tabelle 1 aufgeführt.

(A) Repräsentative Kalibrierungskurve für tNGF. (B) tNGF in Schwangerschaftsproben (1) Kontrolle, (2) 1. Trimester, (3) 2. Trimester, (4) 3. Trimester. (C) proNGF (1) Kontrolle, (2) 1. Trimester, (3) 2. Trimester, (4) 3. Trimester.

Für die aufgestockten QCs, also QC3 und QC4, wurde der ermittelte Inter-Assay-Mittelwert für den endogenen tNGF-Gehalt in QC2 zur aufgestockten NGF-Konzentration addiert, um die relative Genauigkeit zu berechnen. Die QC-Daten zu einzelnen und zwischen den Tests sowie die zusammenfassenden Statistiken für tNGF sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Präzision und relative Genauigkeit für proNGF wurden anhand derselben drei Chargen, die für die tNGF-Qualifizierung verwendet wurden, an drei verschiedenen Tagen auf fünf verschiedenen Ebenen nachgewiesen. Die in Tabelle 2 gezeigten Werte sind die Peakflächenverhältnisse (PAR) des leichten Peptidsignals zum schweren Peptidsignal. Der prozentuale relative Fehler (RE %) als Maß für die relative Genauigkeit wurde anhand der experimentell bestimmten durchschnittlichen PAR-Werte für niedrige und hohe QCs (proQCL und proQCH) und durch Vergleich der experimentellen mit der extrapolierten, theoretischen PAR-Reaktion für die beimischenden QCs (proQCM1) berechnet , proQCM2 und proQCM3). Der Mittelwert zwischen den Tests, CV % und RE % für proNGF-Qualifizierungs-QCs betrugen proQCL 0,0699, 18,4 % (kein RE); proQCM1: 0,115, 25,6 %, 19,1 %; proQCM2: 0,131, 22,4 %, 7,09 %; proQCM3 0,156, 15 %, 4,69 %; proQCH: 0,175 bzw. 18,2 % (kein RE). Der proNGF-Inter-Assay-CV-Bereich betrug 15,0–25,6 %, mit einem RE-Bereich von 4,69–19,1 %.

Wir beobachteten einen 2,6-, 2,5- und 2,0-fachen Unterschied in den Signalen zwischen proQCH und proQCL für die Qualifikationsläufe 1, 2 und 3, was einem durchschnittlichen Unterschied von 2,37-fach über die Qualifikation hinweg entspricht (Abb. 2).

Der mittlere proNGF-L:H-PAR (leichtes:schweres Peakflächenverhältnis) für alle proNGF-QCs, die durch Mischen von proQCL mit proQCH erzeugt wurden, zeigt einen 2,37-fachen Anstieg des proNGF-L:H-PAR von proQCL zu proQCH.

Während der Analyse der Proben wurden alle tNGF-Werte für QCs und Unbekannte parallel auf zwei 96-Well-Platten mit einer Kalibrierungskurve mit vier Replikaten gemessen und die QC-Proben auf die beiden Platten aufgeteilt. Die relativen Fehler wurden anhand des am Tag der Analyse gemessenen endogenen QC2-Spiegels berechnet, addiert zur Menge des zugesetzten NGF (Tabelle S1). Die proNGF-QCs erfüllten die Akzeptanzkriterien basierend auf CV und relativer Abweichung von der nominalen Konzentration, die durch den proNGF-Gehalt bestimmt wurde, der für proQCL und proQCH am Tag der Analyse gemessen wurde, wobei zur Berechnung des theoretischen Werts der Mittelwert von proQCH und proQCL mit dem entsprechenden Mischschema verwendet wurde Verhältnis für proQCM2 (Tabelle S2).

Die Werte für tNGF und proNGF in der Kohorte werden nach Trimester sowie der nicht schwangeren Kontrolle gruppiert (Abb. 3). Die Daten zeigen einen signifikanten Anstieg der zirkulierenden tNGF-Spiegel von der Kontrollgruppe bis zum zweiten und dritten Trimester und keinen signifikanten Anstieg der zirkulierenden proNGF-Spiegel in denselben Gruppen. Es wurden keine signifikant mit tNGF assoziierten Kovariaten gefunden. Wir haben von allen 103 Patienten Altersinformationen erhalten und eine altersbezogene Analyse beider Peptide durchgeführt. Unter 103 Patienten mit tNGF-Daten beträgt die Rangkorrelation zwischen dem Alter der einzelnen Probanden und tNGF -0,153 mit einem ap-Wert von 0,126. Die Rangkorrelation zwischen dem Alter der einzelnen Probanden und proNGF beträgt 0,124 mit einem p-Wert von 0,220. In einem linearen Regressionsmodell, angepasst an das Trimester, gibt es keinen signifikanten Zusammenhang zwischen tNGF und Alter mit einem ap-Wert von 0,079; oder zwischen proNGF und Alter mit einem ap-Wert von 0,173 (Abbildung S1). Repräsentative Ionenchromatogramme für tNGF und proNGF ausgewählter nicht schwangerer Kontrollpersonen aus dem ersten, zweiten und dritten Trimester sind in Abb. 1B bzw. C dargestellt. Einzelne Werte für die menschliche Schwangerschaftskohorte für tNGF und proNGF finden Sie in den Zusatzinformationen (Tabelle S3 bzw. Tabelle S4).

(A) tNGF- und (B) proNGF-Spiegel in Nichtschwangerschafts- und Schwangerschaftskohorten, aufgeschlüsselt nach Trimester. Unter jedem Diagramm werden der Mittelwert und die Standardabweichung (SD) für jede Gruppe sowie der p-Wert im Vergleich zur Kontrollgruppe (nicht schwanger) angezeigt. Linien geben den Mittelwert jeder Gruppe an.

In diesem Bericht beschreiben wir sowohl die quantitative Messung von tNGF in menschlichem Serum mittels IA-LC-MS/MS55 einer Kohorte schwangerer und nicht schwangerer Frauen als auch die neuartige relative Quantifizierung von proNGF unter Verwendung derselben Methodik in einem Duplex-Assay Format. Die Anpassung des Assays an ein Duplexformat ermöglichte die Messung beider Proteine ​​in einem einzigen Lauf, da der IA-LC-MS/MS-Assay nur ein einziges Capture-Antikörperreagenz erfordert. Die im Kontrollserum gemessenen Basalspiegel von Serum-tNGF waren mit den zuvor mittels IA-LC-MS/MS55 ermittelten Werten vergleichbar und blieben, obwohl Ligandenbindungsassays mit höherer Empfindlichkeit für NGF verwendet werden, mit einer zehnfach höheren Empfindlichkeit messbar als einige zuvor veröffentlichte ELISA-Studien58.

Hier zeigen wir, dass sich die mittleren tNGF-Werte zwischen der nicht schwangeren Kontrollgruppe und dem ersten Trimester nicht wesentlich ändern. Allerdings stiegen die Werte vom ersten zum zweiten Trimester und wiederum, wenn auch bescheidener, vom zweiten zum dritten (1,5-fach bzw. 1,1-fach), jedoch mit statistischer Signifikanz basierend auf dem p-Wert (Abb. 3). Der mittlere Gesamtanstieg ab dem letzten Schwangerschaftstrimester betrug im Vergleich zur nicht schwangeren Kontrollgruppe das 1,7-Fache und war, basierend auf den p-Werten, signifikant. Dieser Anstieg war größer als die beobachtete Variabilität, die während der Testqualifizierung festgestellt wurde. Frühere Studien haben kleine, nicht signifikante Veränderungen im zirkulierenden reifen NGF-Spiegel während der menschlichen Schwangerschaft gezeigt59,60 und obwohl die in dieser Studie enthaltenen Daten einen kleinen, aber signifikanten Anstieg des tNGF im Laufe der Schwangerschaft zeigen, stimmen sie im Allgemeinen mit zuvor veröffentlichten Werten überein48, 59.

Basierend auf den p-Werten veränderten sich die proNGF-Werte im Verlauf der Schwangerschaft nicht signifikant. Es hat sich gezeigt, dass zirkulierende proNGF-Spiegel (oder gespaltene Derivate) durch ELISA messbar sind und je nach Krankheitszustand variieren, obwohl eine bioanalytische Charakterisierung des Tests fehlt61. Zuvor wurde gezeigt, dass die proNGF-Spiegel während der Trächtigkeit im Uterusgewebe von Mäusen ansteigen. Wie sich jedoch bei der Variation der NGF-Spiegel zwischen den Spezies zeigt, kann es schwierig sein, die proNGF-Spiegel anhand der absoluten zirkulierenden Werte zwischen den Spezies zu vergleichen45. Die proNGF-Spiegel stiegen in der Schwangerschaft beim Menschen sicherlich nicht an, wie dies bei Ratten beobachtet wurde45, was den möglichen allgemeinen Unterschied in der Rolle von proNGF in der Schwangerschaft zwischen den Arten unterstreicht. Dies unterstreicht jedoch auch die Notwendigkeit, sorgfältig qualifizierte Tests zu verwenden, um sicherzustellen, dass beobachtete Veränderungen in den reifen NGF- oder proNGF-Spiegeln nicht durch bioanalytische Probleme verfälscht werden.

Hier etablieren wir eine empfindliche und selektive LC-MS/MS-Methode zum Nachweis von tNGF und proNGF, die gleichzeitig gemessen werden kann, was der Messung dieser Neurotrophine in ihren verschiedenen Rollen als Biomarker in der Schwangerschaft, der Entwicklung des Nervensystems und bei Krankheiten Spezifität verleiht Zustände im Vergleich zu derzeit eingesetzten Technologien.

Lyophilisierter rekombinanter menschlicher β-Nerve Growth Factor (rhβ-NGF) (Katalog-Nr. 256-GF-100; R&D Systems, Minneapolis, MN) wurde in 0,2 % Rinderserumalbumin (Katalog-Nr. Millipore-Sigma, Burlington, MA) in 10 hergestellt mM phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4. Es wurden viele Humanseren von BioIVT gepoolt (Various; Westbury, NY). Die stabil isotopenmarkierten Peptide NGF-H2N-AWRFIRIDTACVCV[+7 Da]L[+6 Da]SRKAVRRA-OH (New England Peptides, Gardner, MA) und proNGF-H2N-LRSPRVLFSTQPPR[+10 Da]EAADT-OH (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) wurden durch Aminosäureanalyse quantifiziert, bei 5 nmol/ml bei −80 °C gelagert und zur Erzeugung der internen Standardpeptid-Stammlösung in Konzentrationen von 6,67 bzw. 1,67 pmol/µL verwendet und weiter verdünnt auf 0,90 bzw. 0,23 fmol/µL. Polyklonaler Ziegen-Anti-β-NGF-Antikörper (Katalog-Nr. AF-256 R&D Systems, Minneapolis, MN) wurde unter Verwendung von EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific; Rockford, IL) in PBS biotinyliert. Der ligandenaffinitätsgereinigte polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen das tryptische NGF-abgeleitete Peptid IDTACVCVLSR wurde von New England Peptide (Gardner, MA) erhalten, und der proNGF-ligandenaffinitätsgereinigte polyklonale Kaninchen-Antikörper gegen das tryptische proNGF-abgeleitete Peptid VLFSTQPPR wurde von ThermoFisher Scientific (Waltham) erhalten , MA). Antipeptid-Antikörpersäulen wurden wie zuvor beschrieben hergestellt, wobei die Antikörper (ungefähr 1,0 mg pro Peptid) unter Verwendung von Dimethylpimelimidat (Pierce Protein Research Products/Thermo Scientific; Rockford, IL) an Protein-G (Poros-G Applied Biosystems, Bedford, MA) konjugiert waren. zur Vernetzung. Ersatzmatrix (1 % Milchlösung) wurde durch Auflösen von 0,5 g Milchpulver in 50 ml sterilem Milli-Q-Wasser hergestellt und weiter zu Arbeitslösungen in Ersatzmatrix verdünnt.

Es wurde eine Ersatzmatrix in sterilem Milli-Q-Wasser hergestellt. Humanserum wurde als QC für NGF und proNGF QC low verwendet. Zuvor analysierte, gepoolte Chargen menschlichen Serums von BioIVT wurden als proNGF-QC-High sowie im oben beschriebenen proNGF-QC-Mischschema verwendet.

Ein Aliquot von 200 μl Serum, Kalibriermitteln oder Qualitätskontrollprobe (QC) wurde nach Verdünnung mit 650 μl 0,5 % BSA in 10 mM PBS in eine Eppendorf LoBind Deep-Well-Platte gegeben. Zu jeder Probe wurden 10 μl biotinylierter Anti-NGF-Antikörper gegeben, die Platte versiegelt und über Nacht bei 4 °C (550 U/min) geschüttelt. Dynabeads Streptavidin MyOne C1 wurden einmal mit 0,05 % Tween 20 in PBS resuspendiert und gewaschen. Zu jeder Probe wurden 25 μl C1-Kügelchen gegeben und 45 Minuten lang unter Schütteln (1000 U/min) bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben zur Perlenverarbeitung auf den Hamilton Star gelegt. Die Probe und die resuspendierten Perlen wurden in 5 × 300-µL-Transfers (einschließlich abschließender Wäsche/Transfer) auf eine 0,5-ml-Protein-Lobind-Sammelplatte übertragen. Bei jedem Transfer ließ man die Proben 4 Minuten lang auf einem Magnetständer ruhen und der Überstand wurde zum Abfall abgesaugt. Es wurden zwei aufeinanderfolgende Waschgänge mit 300 µL 0,1 % CHAPS in PBS und ein abschließender Waschgang mit 300 µL 10 mM PBS durchgeführt, wobei die Proben 4 Minuten lang auf einem Magnetständer ruhen durften und der Überstand zum Abfall abgesaugt wurde. Die Proteine ​​wurden mit 140 µL 30 mM HCl in 5 % ACN in Wasser eluiert, 5 Minuten gemischt, 5 Minuten auf einem Magnetständer ruhen gelassen und der Überstand auf die endgültige Sammelplatte übertragen und mit 35 µL 1 M TRIS neutralisiert. pH-Wert 8,3. In jede Vertiefung wurden zehn µl Arbeitslösung mit internem Standard gegeben. Die abschließende Aufarbeitung umfasste die Zugabe von 15 µL 75 mM TCEP-Reduktionslösung (vor der Zugabe frisch zubereitet) und eine Inkubation bei 60 °C für etwa 45 Minuten. Man ließ die Platte etwa 10 Minuten lang auf RT abkühlen; und 15 µL 150 mM IAA wurden zu jeder Probenvertiefung gegeben und im Dunkeln bei RT etwa 35 Minuten lang inkubiert. Abschließend wurde der Probenverdau mit 10 µL einer 100 µg/ml LysC/Trypsin-Lösung bei 37 °C über Nacht durchgeführt.

85 µl wurden in ein HPLC-System injiziert, das eine Anti-Peptid-Antikörpersäule enthielt, um die interessierenden tryptischen Peptide vor der Umkehrphasen-Nanoflow-Chromatographie anzureichern, bestehend aus Ultimate 3000 (ThermoFisher Scientific) mit den folgenden Modulen: WPS-3000RS temperaturgesteuerter Autosampler, ausgestattet mit einem 250 µL Probenschleife; HPG-3400RS binäre Schnelltrennpumpe (Mikropumpe); NCS-3500RS Nano LC-System (Ladepumpe und Nanopumpe); Säulenofen TCC-3200RS (Antikörpersäule); NCS 3500 RSC-Säulenofen, der die Ventile 2, 3 und die Trap-Säule umschließt (Thermo-µ-Vorsäulenkartusche P/N 164649), ausgestattet mit einem Acclaim PepMap100 C18, 5 µm, 100 Å 300 µm ID × 5 mm (60 °C). Der LC war mit einem Thermo Quantiva Triple Quadrupol mit einer Thermo Fisher Easy Spray Ionization Source verbunden. Die analytische Säule ist Thermo Easy Spray PepMap C18, 75 µm × 15 cm (Best.-Nr. ES800) (60 °C). Die im LC-MS/MS-Assay überwachten MRM-Übergänge für beide Proteine ​​sind in Tabelle S5 aufgeführt.

Der Assay wurde mit Standards bei 0, 10, 20, 40, 80, 160, 320 und 640 pg/ml NGF in 1 % Milch (n = 2) kalibriert. NGF-Konzentrationen in QC-Proben oder Unbekannten wurden in TraceFinder 4.1 General Quan unter Verwendung einer linearen Regressionsanalyse (gewichtet: 1/ × 2) zurückberechnet, die auf die Kalibrierungskurve angewendet wurde. Präzision und Genauigkeit der tNGF-Analyse wurden an drei verschiedenen Tagen in vier Konzentrationen und mit sechs Replikaten unter Verwendung von QC1 (0,5 × endogen), QC2 (endogene tNGF-Spiegel, nicht angereichert), QC3 (endogen + 45 pg/ml NGF) und QC4 getestet (endogen + 450 pg/ml NGF). Eine Stabilitätsbewertung wurde über einen Gefrier-Tau-Zyklus für QC3 und QC4 bei –70 °C (n = 6) durchgeführt; und bei RT für 4 Stunden auf den Niveaus von QC3 und QC4 (n = 6).

Zur analytischen Auswertung des Schwangerschaftskohortenlaufs; Vier Replikate der einzelnen Kalibrierungsstandards wurden auf die beiden 96-Well-Platten verteilt, und die Qualitätskontrollproben wiesen Konzentrationen von QC2 auf; QC3 und QC4 wurden auf beide Platten aufgeteilt, mit einem n von 8 für jede Ebene (n von 4 auf jeder Platte).

Für proNGF wurde ein relativer Quantifizierungsansatz verwendet, der nicht die Verwendung eines Kalibrierungsstandards beinhaltete. Stattdessen wurde ein Ad-Misch-Schema entwickelt, um Mengen menschlichen Serums zu messen, die einen hohen (proQCH) und einen niedrigen (proQCL) Gehalt an proNGF aufwiesen. Das Millipore-Sigma-Serum wurde für proQCL verwendet und das proQCH wurde durch Kombination von BioIVT-Serumchargen hergestellt, bei denen separat festgestellt wurde, dass sie hohe proNGF-Werte aufwiesen. Die drei mittleren QC-Level wurden durch Mischen von proQCL und proQCH in unterschiedlichen Verhältnissen hergestellt: proQCM1: 75 % proQCL und 25 % proQCH; proQCM2 50 % proQCL und 50 % proQCH; proQCM3 25 % proQCL und 75 % proQCH. Die proNGF-Messung wurde durchgeführt, indem das Verhältnis der Signalfläche des leichten Peptids zu der des schweren (stabil isotopenmarkierten) Peptids ermittelt wurde.

In dieser Studie gab es vier Kohorten, darunter schwangere Frauen, die über drei Trimester Proben lieferten (Gruppe I: erstes Trimester, Woche 1–13, n = 24; Gruppe II: zweites Trimester, Woche 14–26, n = 28; Gruppe III: drittes). Trimester, Woche 27–40, n = 22) mit Proben, die etwa in der Mitte jedes Trimesters entnommen wurden, und den Kontrollproben (Gruppe IV: nicht schwanger, n = 29). Die nichtschwangere Kontrollkohorte wurde so ausgewählt, dass sie möglichst genau mit den Schwangerschaftskohorten übereinstimmt. Die Mitglieder der Schwangerschaftskohorten sind kaukasischer Abstammung, > 18 Jahre alt, und die Schwangerschaft wurde durch einen HCG-Test und/oder Ultraschall bestätigt. Die Proben stammen von einer separaten Kohorte von Frauen in jedem Schwangerschaftsstadium. Probanden wurden ausgeschlossen, wenn sie in der Vergangenheit illegalen Drogenkonsum, aktuelle Infektionen wie HIV, Zika, durch Blut übertragene sexuell übertragbare Krankheiten, Sichelzellenanämie oder eine andere bekannte Krankheit hatten, die sich physiologisch auf die Studie auswirken könnte. Vorherige Infektionen mit Hepatitis B/C, HIV-1, HIV-2, Syphilis und Tuberkulose wurden ebenfalls ausgeschlossen. Informationen über den Ausgang der Schwangerschaft, z. B. Lebendgeburt, Einling oder Zwillinge, waren nicht verfügbar. Das Serum wurde von Cureline, Inc. (Brisbane, CA, USA) mit ethischer Genehmigung des WCG Institutional Review Board (WCG IRB-Referenznr.: 20140236; Cureline-Studiennr. 1144700) gesammelt. Dieses IRB entspricht vollständig den guten klinischen Praktiken, wie sie in den Vorschriften der US-amerikanischen Lebensmittel- und Arzneimittelbehörde (FDA), den Vorschriften des US-Gesundheitsministeriums (HHS) und den Richtlinien der International Conference on Harmonisation (ICH) definiert sind. Die Teilnehmer gaben ihr schriftliches Einverständnis, dass ihre Proben in der biomedizinischen Forschung verwendet werden dürfen. Alle Analysemethoden wurden in Übereinstimmung mit den relevanten Pfizer-Richtlinien und Best Practices durchgeführt.

Zuvor wurde festgestellt, dass die tNGF-Konzentrationen im Serum gesunder Probanden einen Variationskoeffizienten von etwa 30 % aufweisen55. Daher wurde diese Studie so konzipiert und betrieben, dass ein Unterschied der tNGF-Konzentration zwischen zwei Gruppen von 25–30 % festgestellt werden kann. Dies erfordert eine Stichprobengröße von etwa 20–25 pro Gruppe bei einer Aussagekraft von 80 %. Es wurden statistische Analysen durchgeführt, um das zweite und dritte Trimester mit dem ersten zu vergleichen und die linearen Trends sowohl über die Semester hinweg als auch über alle vier Gruppen hinweg zu ermitteln. Vor der statistischen Analyse wurde eine logarithmische Transformation auf tNGF angewendet, um seine Variabilität zwischen den Gruppen zu stabilisieren. Die Auswirkungen der Schwangerschaft wurden in einem einfaktoriellen Varianzanalysemodell (ANOVA) analysiert. Potenzielle Kovariaten wurden untersucht und angepasst, wenn sie signifikant mit tNGF oder proNGF assoziiert waren. Vergleiche zwischen verschiedenen Trimestern und nicht schwangeren Frauen sowie lineare Trends über Trimester hinweg wurden mithilfe von Kontrasten im Rahmen des ANOVA-Modells getestet. Es waren keine Anpassungen für Mehrfachvergleiche erforderlich und die statistische Signifikanz wurde erreicht, wenn die p-Werte weniger als 0,05 lagen (siehe Abb. 3). Alle Analysen wurden in R 3.5.0 durchgeführt.

Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Diese Forschung wurde von Pfizer Inc. gesponsert. Cureline Inc. stellte die Kohorte von Schwangerschaftsproben zur Analyse zur Verfügung.

Pfizer Inc., 1 Burtt Road, Andover, MA, 01810, USA

Jason Walsh, Joe Palandra und Hendrik Neubert

Pfizer Inc., 1 Portland St, Cambridge, MA, 02139, USA

Eduward Goihberg

Pfizer Inc., 10777 Science Center Drive, San Diego, CA, 92121, USA

Shibing Deng

Pfizer Inc., 445 Eastern Point Road, Groton, CT, 06340, USA

Susan Hurst

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Studiendesign und -konzept: JW, JP, HN, SH Durchgeführte Assays und andere Forschung: JW, JP, EG Datenanalyse und Interpretation: JW, JP, HN, SH, SD Manuskripterstellung: Alle Autoren. Durchsicht und Überarbeitung des Manuskriptinhalts: Alle Autoren.

Korrespondenz mit Jason Walsh.

Die Autoren erklären die folgenden konkurrierenden finanziellen Interessen: Alle Autoren sind oder waren zum Zeitpunkt der Durchführung dieser Studien Mitarbeiter von Pfizer Inc.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Walsh, J., Palandra, J., Goihberg, E. et al. Analyse des β-Nervenwachstumsfaktors und seines Vorläufers während der Schwangerschaft beim Menschen mittels Immunaffinitäts-Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie. Sci Rep 13, 9180 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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Eingegangen: 14. Dezember 2022

Angenommen: 05. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34695-7

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