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May 07, 2023

Präklinische Charakterisierung und Anti

Signalübertragung und gezielte Therapie

Signal Transduction and Targeted Therapy Band 8, Artikelnummer: 27 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Sehr geehrter Herausgeber,

Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2), der Erreger der globalen pandemischen Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), hat sich als hochvirulenter Atemwegserreger mit unvorhersehbarer Evolutionsfähigkeit erwiesen und stellt eine anhaltende Bedrohung dar zur Menschheit. Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung dieses Manuskripts zeichnet sich die dominante Omicron-Variante durch eine deutlich höhere Infektiosität aus, und die neu auftretenden Subvarianten weisen im Wesentlichen eine entkommende Neutralisierung auf, die sowohl durch die Impfung als auch durch eine frühere Infektion hervorgerufen wurde, was das Risiko eines Impfstoffdurchbruchs oder einer erneuten Infektion erhöht.1 Wirksame antivirale Medikamente werden dringend als Gegenmaßnahme benötigt, um die Virusübertragung und das Risiko des Fortschreitens der Krankheit zu einer kritischen Erkrankung oder zum Tod zu verringern.

Remdesivir (RDV) ist das erste Nukleotidanalogon, das zur Behandlung von COVID-19 zugelassen ist. Eine frühzeitige Verabreichung von RDV an nicht hospitalisierte Hochrisikopatienten könnte das Risiko einer Krankenhauseinweisung oder eines Todesfalls um 87 % senken.2 Da es sich jedoch um ein obligatorisches intravenöses Medikament handelt, ist RDV für ambulante COVID-19-Patienten nicht ohne weiteres zugänglich. Zuvor haben wir herausgefunden, dass das ursprüngliche 1′-CN-4-aza-7,9-dideazaadenosin-C-Nukleosid (GS-441524) in vitro wirksamer gegen SARS-CoV-2 war als RDV.3 Als fortlaufende Anstrengung zur Verbesserung Wir berichten hier über die präklinische Charakterisierung und Anti-SARS-CoV-2-Wirksamkeit eines potenziellen oralen Nukleosid-Arzneimittelkandidaten, ATV014.

Zunächst haben wir eine Reihe von Adenosinderivaten entworfen und synthetisiert, die auf der Prodrug-Strategie basieren, indem wir selektiv Ester an der 5'-OH-Gruppe von GS-441524 einführen, um 4a~4 m zu erhalten (ergänzende Abbildung S1). Unter diesen neu synthetisierten Verbindungen wurde das Cyclohexylcarboxylat-Analogon 4a (ATV014) (Abb. 1a, EC50 = 0,48 μM) als wirksames Mittel gegen das SARS-CoV-2-Replikon identifiziert, das etwa 3,4-fach wirksamer war als das von GS -441524 (EC50 = 1,644 μM) (Ergänzungstabelle S1). ATV014, das Tetrahydro-2H-pyran-4-carboxylat-Analogon (4 h) und das Palmitat-Analogon (4 l) wurden ausgewählt, um das PK-Profil bei SD-Ratten zu vergleichen (Ergänzungstabelle S2). Mit einer oralen Einzeldosis von 25 mg/kg zeigte ATV014 eine Verbesserung der oralen Bioverfügbarkeit (F%) um 53,4 % und eine T½ von 1,9 Stunden, die besser ist als die von 4 Stunden und 4 l. Aufgrund der günstigen oralen PK und Wirksamkeit wurde ATV014 für weitere Anti-SARS-CoV-2-Experimente mit lebenden Viren ausgewählt. Wie in Abb. 1b gezeigt, sind die antiviralen Aktivitäten von ATV014 in Vero E6-Zellen gegen B.1 (IC50 = 0,46 μM), Beta (IC50 = 0,13 μM), Delta (IC50 = 0,24 μM) und Omicron (IC50 = 0,013 μM). ) wurden im Vergleich zu RDV und GS-441524 deutlich verbessert. Die durchschnittlichen Werte der zytotoxischen Konzentration (CC50) von ATV014 in Vero E6-Zellen betrugen 263,8 μM. Bemerkenswert ist, dass der therapeutische Index (CC50/EC50) von ATV014 gegen die Omicron-Variante 20292 erreichte. Darüber hinaus zeigte ATV014 gegen den B.1-Stamm in A549-ACE2-Zellen einen EC50-Wert von 0,0562 ± 0,016 µM (ergänzende Abbildung S2). Diese Ergebnisse zeigten die hohe Wirksamkeit, insbesondere gegen das kürzlich weit verbreitete Omicron, und die relativ geringe Toxizität von ATV014.

Definition eines potenziellen oralen Anti-SARS-CoV-2-Medikaments ATV014 und dessen präklinische Charakterisierung. a Die chemischen Strukturen von Remdesivir, GS-441524 und ATV014. b Antivirale Aktivität von RDV, GS-441524 und ATV014 gegen B.1-, Beta-, Delta- und Omicron-Stämme von SARS-CoV-2 und entsprechende Zytotoxizität in Vero-E6-Zellen. c Schematische Darstellung der prophylaktischen Wirksamkeit in einem K18-hACE2-Mäusemodell. K18-hACE2-Mäuse wurden intranasal mit der SARS-CoV-2-Delta-Variante (5 × 102 PFU-Virus pro Maus) geimpft und sofort oral mit Vehikel ATV014 (100, 300 mg/kg) oder EIDD-2801 (300 mg/kg) behandelt ), vor der Inokulation und drei Tage lang fortgesetzt (bis in die (BID), n = 4 pro Gruppe). Die folgenden Ergebnisse zeigten die Häufigkeit von SARS-CoV-2-N-Genkopien in der Lunge von Mäusen mittels qRT-PCR (quantitative Echtzeit-Polymerasekettenreaktion) und die Lebensfähigkeit des Virus mittels FFA (Focus Forming Assay) bei 3 dpi. Die Nachweisgrenze der qRT-PCR lag bei 0,5 Kopien/μL. Die rote gestrichelte Linie zeigt die Nachweisgrenze für die FFA an. d Flussdiagramm der therapeutischen Wirksamkeit. K18-hACE2-Mäuse wurden intranasal mit der SARS-CoV-2-Delta-Variante (5 × 102 PFU pro Maus) geimpft und mit Vehikel ATV014 (10, 20, 50, 100 oder 200 mg/kg) oder EIDD-2801 behandelt (200 mg/kg) zwei Stunden nach der SARS-CoV-2-Infektion (n = 10 pro Gruppe). Die folgenden Ergebnisse zeigten die Häufigkeit von SARS-CoV-2-N-Genkopien in der Mauslunge mittels qRT-PCR und die Lebensfähigkeit des Virus mittels FFA bei 3 dpi. e Repräsentative H&E-Bilder von Lungenabschnitten der mit Vehikel behandelten, mit 100 mg/kg ATV014 behandelten und mit 200 mg/kg ATV014 behandelten Mäuse. f Mittlere Plasmakonzentrationen von ATV014 nach einmaliger intravenöser (1,0 mg/kg) und oraler (5 und 20 mg/kg) Verabreichung von ATV014 bei CD1-Mäusen (n = 3 pro Gruppe). einmalige intravenöse (1,0 mg/kg) und orale (20, 40 und 80 mg/kg) Verabreichung von ATV014 an SD-Ratten (n = 6 pro Gruppe) und einmalige intravenöse (1 mg/kg) und orale (5, 15 und 45 mg/kg) Verabreichung an Beagle-Hunde (n = 6 pro Gruppe). g Gewebeverteilung des Schlüsselmetaboliten GS-441524 bei männlichen Ratten nach einmaliger oraler Verabreichung von ATV014 mit 80 mg/kg. SI: Dünndarm; LI: Dickdarm. Fehlerbalken zeigen SEM an. Zur statistischen Analyse wurde ein Kruskal-Wallis-Test verwendet. ∗P ≤ 0,05; ∗∗P ≤ 0,005; ∗∗∗P ≤ 0,0005; ∗∗∗∗P ≤ 0,0001

Anschließend bewerteten wir die in vivo prophylaktische und therapeutische Wirksamkeit von oralem ATV014 bei mit der Delta-Variante infizierten transgenen K18-hACE2-Mäusen (Abb. 1c und 1d) mit Molnupiravir (EIDD-2801) als Referenzverbindung.5 Die Behandlung wurde zu diesem Zeitpunkt eingeleitet der Infektion im prophylaktischen Modell. Drei Tage nach der Inokulation (dpi) waren die Virus-RNA-Kopien bei Mäusen, die mit ATV014 (100 und 300 mg/kg, BID) behandelt wurden, signifikant reduziert. Die mittels FFA (Focus Forming Assay) gemessenen Virustiter bei mit ATV014 behandelten Mäusen wurden auf nahezu die Nachweisgrenze gesenkt, was darauf hindeutet, dass die infektiösen Viren in der Lunge deutlich eliminiert wurden. Um die niedrigste wirksame Dosis im therapeutischen Umfeld zu bestimmen, wurde ATV014 2 Stunden nach der Infektion verabreicht. 20, 50, 100 und 200 mg/kg ATV014 reduzierten dosisabhängig die virale RNA in der Lunge. ATV014 reduzierte bei 200 mg/kg die virale RNA signifikant um etwa zwei Größenordnungen (1,4 × 103 Kopien/μl im Vergleich zu 1,7 × 105 Kopien/μl in der Vehikelgruppe), was im Vergleich zu 200 mg/kg Molnupiravir wirksamer war (5,4 ×). 103 Kopien/µl). Im Focus-Forming-Assay reduzierten 50 mg/kg und höhere Dosierungen von ATV014 die Konzentration des infektiösen Virus unter die Nachweisgrenze. Die histopathologische Analyse ergab, dass ATV014 das Lungengewebe vor interstitiellen entzündlichen Läsionen und Schäden durch eine SARS-CoV-2-Delta-Infektion schützte (Abb. 1e).

Der Syntheseprozess von ATV014 im Kilomaßstab wurde optimiert, um die Versorgung für die klinische Studie sicherzustellen. ATV014 wurde als Anhydrat mit hoher Kristallinität erhalten und war bei 40 °C/75 % relativer Luftfeuchtigkeit (offen) und 60 °C (offen) 30 Tage lang physikalisch stabil und zeigte eine gute chemische Stabilität. ATV014 hatte einen günstigen experimentellen log P-Wert von 1,99 und einen pKa-Wert von 3,5. GS-441524 zeigte in Permeabilitätstests für Caco-2-Zellen eine mäßig niedrige Permeabilität mit einem Papp-Wert (A bis B) von 3,62 cm/s × 10−6. Im Gegensatz dazu verhielt sich ATV014 wie eine meso-hypertonische Verbindung (Papp (A zu B) = 8,69 cm/s × 10−6) und war ein schwacher Substrat-Efflux-Transporter mit einer Efflux-Rate von 2,5 (Ergänzungstabelle S3). Die Verbesserung der passiven Absorptionspermeabilität erklärte teilweise die verbesserte orale Absorption von ATV014. Nach einmaliger oraler Verabreichung von 20, 40 und 80 mg/kg ATV014 an SD-Ratten betrug die Bioverfügbarkeit (F) 49 %, 43 % bzw. 68 % (Abb. 1f und Ergänzungstabelle S4). Im Vergleich dazu betrug die orale Bioverfügbarkeit von GS-441524 nach Verabreichung von RDV bei Ratten nur 14 % (Ergänzungstabelle S5). Unterdessen lag die orale Bioverfügbarkeit von GS-441524 nach Verabreichung von ATV014 bei Mäusen zwischen 66 und 69 % und bei Beagle-Hunden zwischen 78 und 105 % (Abb. 1f und Ergänzungstabelle S6). Cmax und AUC stiegen bei allen drei Arten dosisabhängig an. Bei der 7-tägigen wiederholten Verabreichung von oralem ATV014 an Ratten (40 mg/kg, zweimal täglich) und Hunden (15 mg/kg, zweimal täglich) waren die AUClast- und Cmax-Werte an Tag 1 und Tag 7 gleich, was darauf hindeutet, dass es nicht zu einer Akkumulation kam im Körper bei wiederholter Dosierung (Ergänzungstabelle S7 und S8).

Eine Stoffwechselstudie zeigte, dass sechs Metaboliten von ATV014 in Inkubationsproben von Mäusen, vier in Inkubationsproben von Ratten, Hunden und Menschen und drei in Inkubationsproben von Affen nachgewiesen wurden (Ergänzungstabelle S9 und Abb. S3). Der hydrolysierte Metabolit M3 (GS-441524) war der Hauptmetabolit in Hepatozyten aller fünf Spezies mit Spitzenflächenprozentsätzen von 93,06 %, 90,27 %, 92,45 %, 96,30 % bzw. 95,64 %. Weitere Gewebeverteilungsstudien zeigten, dass sich der primäre Metabolit GS-441524 in Rattengeweben (Abb. 1g und Ergänzungstabelle S10), insbesondere in der Lunge, weit verbreitet und schnell verteilt und über den therapeutischen Konzentrationen liegt. ATV014, GS-441524 und die aktive Triphosphatform (RTP) zeigten in einem breiten Screening von 87 Zielen ein günstiges Off-Target-Selektivitätsprofil. Die Hemmungsraten lagen bei 20 μM bei allen gescreenten Zielen bei <50 %, mit der Ausnahme, dass ATV014 53 % der Adenosintransporteraktivität inhibierte (Ergänzungstabelle S11). Für die Einzeldosis-Toxizitätsstudien betrug die maximal tolerierte Dosis (MTD) von ATV014 sowohl bei Ratten als auch bei Hunden 2000 mg/kg. In 14-tägigen Studien zur Toxizität bei wiederholter Gabe betrugen die No-observed-adverse-effect-levels (NOAELs) von ATV014 400 mg/kg bzw. 100 mg/kg und die MTD betrug 800 mg/kg bzw. 300 mg/kg bei Ratten und Hunden . ATV014 und GS-441524 zeigten keine Mutagenität oder Klastogenität im Hinblick auf die negativen Ergebnisse im Ames-Test mittels Salmonella-, E. coli- und Mikrokerntest in Knochenmarkszellen. Diese Anti-SARS-CoV-2-Wirksamkeitsstudien und präklinischen Daten validierten ATV014 als wirksames orales antivirales Mittel zur Behandlung von COVID-19 mit günstigen PK-Eigenschaften und Sicherheitsprofil, das in klinischen Studien untersucht wird (Phase 1, NCT05504746; vom Forscher initiierte Studie). , ChiCTR2200064093).

Hachmann, NP et al. Neutralisierungsflucht durch die SARS-CoV-2-Omicron-Subvarianten BA.2.12.1, BA.4 und BA.5. N. engl. J. Med. 387, 86–88 (2022).

Artikel Google Scholar

Gottlieb, RL et al. Frühzeitiges Remdesivir zur Verhinderung des Fortschreitens einer schweren Covid-19-Erkrankung bei ambulanten Patienten. N. engl. J. Med. 386, 305–315 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Li, YJ et al. Der Remdesivir-Metabolit GS-441524 hemmt wirksam die SARS-CoV-2-Infektion in Mausmodellen. J. Med. Chem. 65, 2785–2793 (2022).

Artikel CAS Google Scholar

Cao, L. et al. Das Adenosin-Analogon-Prodrug ATV006 ist oral bioverfügbar und weist eine starke präklinische Wirksamkeit gegen SARS-CoV-2 und seine Varianten auf. Wissenschaft. Übers. Med. https://doi.org/10.1126/scitranslmed.abm7621 (2022).

Jayk Bernal, A. et al. Molnupiravir zur oralen Behandlung von Covid-19 bei nicht hospitalisierten Patienten. N. engl. J. Med. 386, 509–520 (2022).

Artikel Google Scholar

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Diese Arbeit wurde vom Shenzhen Science and Technology Program (JSGG20200225150431472, JSGG20210901145403012 & KQTD20180411143323605), der Guangdong Basic and Applied Basic Research Foundation (Grant #2020A1515110361) und dem National Key Research and Development Program of China (#2021YFC086) unterstützt 5100), Schwerpunkt Forschung und Entwicklung Programm der Provinz Guangdong (2021B1111110001) und der National Natural Science Foundation of China (Zuschuss Nr. 32041002, Nr. 82150206). DG wird außerdem vom Guangdong Zhujiang Talents Program (#2016LJ06Y540) und dem National Ten-thousand Talents Program unterstützt. Die Autoren danken Lu Zhang, Ruyan Liao, Yongxia Shi und Jun Dai vom Guangzhou Customs District Technology Center für die Hilfe beim In-vivo-Wirksamkeitsexperiment. Wir danken auch den anderen Projektteilnehmern, darunter Guanguan Li, Shuo Li und Xinjun Liu von Medi-X Pingshan, Southern University of Science and Technology, für die Unterstützung bei der präklinischen Studie.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Qifan Zhou, Sidi Yang, Liu Cao, Yang Yang, Tiefeng Xu

Shenzhen Key Laboratory of Small Molecule Drug Discovery and Synthesis, Department of Chemistry, College of Science, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies und Medi-X Pingshan, Southern University of Science and Technology, Shenzhen, Guangdong, 518000, China

Qifan Zhou, Qishu Chen, Yingjun Li und Xumu Zhang

Zentrum für Infektions- und Immunitätsstudien (CIIS), School of Medicine, Shenzhen Campus der Sun Yat-sen-Universität, Shenzhen, Guangdong, 518107, China

Sidi Yang, Liu Cao, Tiefeng Xu und Deyin Guo

Guangzhou-Labor, Bio-Insel, Guangzhou, China

Sidi Yang & Deyin Guo

Shenzhen Key Laboratory of Pathogen and Immunity, Nationales klinisches Forschungszentrum für Infektionskrankheiten, staatliche Schlüsseldisziplin für Infektionskrankheiten, Shenzhen Third People’s Hospital, Zweites Krankenhaus der Southern University of Science and Technology, Shenzhen, China

Yang Yang & Hongzhou Lu

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QZ- und QC-synthetisierte Nukleosid-Prodrugs; QZ, YL und SY beteiligten sich an der Dateninterpretation, bereiteten Zahlen und Manuskripte vor; SY führte Tierversuche durch; LC, TX und YY führten virale Replikon- und Hemmungstests auf Zellebene durch; YL analysierte die Ergebnisse der PK- und Toxizitätsstudien; XZ, DG und YL konzipierten und gestalteten das Projekt und initiierten die Zusammenarbeit mit HL; DG und XZ waren als Betreuer für das Gesamtprojekt verantwortlich. Alle Autoren haben den Artikel gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Yingjun Li, Deyin Guo oder Xumu Zhang.

Die Southern University of Science and Technology und die Sun Yat-sen University haben Patentanmeldungen im Zusammenhang mit der Arbeit eingereicht. XZ, DG, LC, Y.Li., TX und QZ sind in dieser Anmeldung als Erfinder aufgeführt. XZ und DG sind Mitbegründer eines Startup-Unternehmens, Shenzhen AntiV Pharma Co., Ltd. Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Alle Tierstudienprotokolle wurden vom Tierschutzausschuss genehmigt und alle in Tierversuchen verwendeten Verfahren entsprachen den Richtlinien und Richtlinien des Tierpflege- und Nutzungsausschusses der jeweiligen Forschungseinheiten.

Präklinische Charakterisierung und Anti-SARS-CoV-2-Wirksamkeit von ATV014: Orales Cyclohexancarboxylat-Prodrug von 1′-CN-4-aza-7,9-dideazaadenosin C-Nukleosid

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhou, Q., Yang, S., Cao, L. et al. Präklinische Charakterisierung und Anti-SARS-CoV-2-Wirksamkeit von ATV014: ein orales Cyclohexancarboxylat-Prodrug von 1′-CN-4-aza-7,9-dideazaadenosin C-Nukleosid. Sig Transduct Target Ther 8, 27 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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Eingegangen: 11. August 2022

Überarbeitet: 08. Dezember 2022

Angenommen: 03. Januar 2023

Veröffentlicht: 12. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01310-0

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